Concentration Analysis of Ultra-microvolume Samples by UV-Vis Spectroscopy

Význam tématu

Analýza ultra-mikroobjemových vzorků bílkovin a nukleových kyselin bez potřeby ředění a destrukce vzorku je v moderních laboratořích stále více žádaná. Minimalizace spotřeby cenných biologických materiálů přispívá k vyšší efektivitě, reproducibilitě a udržitelnosti analytických postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje využití spektrofotometru Agilent Cary 60 UV-Vis doplněného o TrayCell 2.0 Ultra-Microvolume Cell pro přímé stanovení koncentrace bílkovin (BSA) a DNA (herring sperm DNA) v objemech řádu mikrolitrů. Hlavním cílem bylo demonstrovat přesnost, opakovatelnost a rozšířený dynamický rozsah měření bez nutnosti ředění.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byla použita následující instrumentace:

• Agilent Cary 60 UV-Vis spectrophotometer se xenonovou zábleskovou lampou
• TrayCell 2.0 Ultra-Microvolume Cell s výměnnými kapami o délkách optické dráhy 2,0 mm, 1,0 mm, 0,2 mm a 0,1 mm
• Software Agilent Cary WinUV (verze 5.1.3.1042) s Concentration module

Vzorky:

• BSA (Sigma-Aldrich, CAS 9048-46-8) v PBS, sériové ředění do koncentrací 1–400 mg/mL
• Herring sperm DNA (Sigma-Aldrich, CAS 438545-06-3) v PBS, sériové ředění do 5–1500 ng/µL

Vzorek 3–10 µL byl pipetován na měřicí okénko TrayCell a byla nasazena odpovídající kapa s definovanou optickou dráhou.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Citlivost a opakovatelnost: Pro 20 ng/µL DNA (Abs 0,04 při 260 nm) bylo naměřeno 10 opakovaných spekter s vysokou reprodukovatelností.
2) Linearity výkonu:

• DNA: v oblasti 5–1500 ng/µL (ekvivalentní Abs 0,08–2,4 pro 1,0 mm dráhu), R² = 0,9997
• BSA: měření v rozsahu 1–400 mg/mL s využitím kap 1,0 mm (do 40 mg/mL), 0,2 mm (do 200 mg/mL) a 0,1 mm (do 400 mg/mL); dosahovány ekvivalentní Abs až do 200 při 10 mm dráze, R² > 0,998

3) Workflow: Software Concentration module automaticky generuje kalibrační křivku a přímý výpočet koncentrace neznámých vzorků zjednodušuje a zrychluje datové vyhodnocení.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace spotřeby vzorku díky objemu 0,7–10 µL
• Odstranění časově náročných a náchylných ředění
• Rychlé čištění a nízké riziko křížové kontaminace
• Zvýšení udržitelnosti laboratoře díky menší spotřebě plastů a reagencií

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření uplatnění ultra-mikroobjemových buněk v oblastech proteomiky, genomiky a QA/QC. Kombinace s automatizovanými systémovými podavači vzorků a teplotními regulátory umožní sledování kinetiky, termostabilních procesů a vysokoprůtokovou analýzu v miniaturizovaném formátu.

Závěr

Systém Agilent Cary 60 UV-Vis s TrayCell 2.0 nabízí rychlou, precizní a nedestruktivní analýzu ultra-mikroobjemových vzorků. Díky širokému dynamickému rozsahu a jednoduché obsluze je vhodný pro rutinní i pokročilé aplikace v biochemii, výzkumu a průmyslové analytice.

Reference

• Agilent Technologies, Application Note 5994-5455EN, prosinec 2022