Simple and rapid quantitation of microliter DNA samples using the Agilent Cary 50/60 UV-Vis

Význam tématu

Rychlé a přesné stanovení koncentrace nukleových kyselin v mikrolitrových objemech je nezbytné pro moderní molekulárně biologické a biotechnologické aplikace. Minimalizace objemu vzorku zvyšuje propustnost analýz a snižuje náklady na reagencie, přičemž zachovává vysokou kvalitu dat.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost UV-Vis spektrofotometrů Agilent Cary 50/60 vybavených ultra-mikroobjemovou kyvetou pro spolehlivé, reprodukovatelné stanovení koncentrace DNA v objemech řádu jednotek mikrolitrů. Metoda využívá poměr absorbancí při 260 nm a 280 nm pro kvantifikaci a hodnocení čistoty vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava DNA z bakteriálního veektoru pomocí EndoFree Plasmid Giga kitu
• Eluce DNA v endotoxin-volné vodě, odběr 4 µl na ultra-mikroobjemovou kyvetu s drážkou 1,0 mm
• Měření spektrem od 400 nm do 200 nm při rychlém skenovacím režimu
• Vyhodnocení poměru A260/A280 a korekce na pozadí při 320 nm

Instrumentace:

• UV-Vis spektrofotometr Agilent Cary 50 (možno provést i na Cary 60)
• Ultra-mikroobjemová kyveta s krátkou optickou dráhou
• Xe záblesková lampa, spektrální šířka štěrbin <1,5 nm
• Software Cary WinUV s modulem DNA/RNA pro automatickou kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy 4 µl vzorků DNA provedené pětkrát ukázaly poměr A260/A280 v rozsahu 1,740–1,759 a průměrnou koncentraci 1 224,5 ± 3,6 µg/ml (RSD 0,29 %). Porovnání s konvenční kyvetou o délce dráhy 10 mm na 400 µl rozřeďovaných vzorcích přineslo průměrnou koncentraci 117,8 ± 0,2 µg/ml (RSD 0,17 %), čímž byla prokázána obdobná přesnost i při použití minimálních objemů. Díky malé optické dráze lze pokrýt rozsah absorbancí přes 150 Abs bez potřeby ředění.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Výrazné snížení spotřeby vzorku a reagencií
• Rychlý průběh analýzy (sken i výpočet do 2 s)
• Nízkou variabilitu měření <0,3 % RSD
• Možnost přímého měření biologických vzorků bez ředění

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj mikrofluidických systémů integrovaných s ultra-mikroobjemovými kyvetami umožní plně automatizované a vysoko-propustné analýzy DNA i proteinů. Další aplikace mohou zahrnovat screening enzymatických reakcí, detekci biomarkerů a pokročilé studiové protokoly v oblasti genomiky a proteomiky.

Závěr

Agilent Cary 50/60 s ultra-mikroobjemovou kyvetou poskytují robustní a vysoce přesnou metodu pro kvantitativní stanovení DNA v objemu již od 4 µl. Kombinace malé optické dráhy, intenzivního zdroje a citlivého detektoru zajišťuje výbornou reprodukovatelnost a široký dynamický rozsah měření.

Reference

Warburg O. a Christian W. Biochem Z., 310, 384 (1942)