A Systematic Quick Method Development Approach to Optimize Protein Size Exclusion Chromatography

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je klíčová technika pro charakterizaci terapeutických proteinů, zejména pro kvantifikaci a rozlišení monomerů a agregátů. Robustní metoda SEC umožňuje zamezit nespecifickým elektrostatickým či hydrofobním interakcím a zajistit entropicky řízené dělení podle velikosti biomolekul. Efektivní optimalizace SEC podmínek šetří čas i náklady a zvyšuje spolehlivost analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři navrhují rychlý systematický přístup pomocí 2³ faktoriálního designu experimentů (DoE) k optimalizaci SEC pro proteiny. Cílem je prozkoumat vliv tří hlavních faktorů – síly pufru, koncentrace organického modifikátoru a teploty kolony – na kvalitu chromatografické separace. Studie představuje aplikaci na dva monoklonální protilátky a jeden konjugát protilátka-léčivo.

Použitá metodika a instrumentace

• Design experimentu: 2³ plný faktoriální design, 8 experimentálních běhů, modelování lineárním modelem.
• Faktory:
  
  • Mobilní fáze – síla PBS pufru (1× a ½× koncentrace).
  • Organický modifikátor – Metanol 2 % a 10 % obj.
  • Teplota kolony – 25 °C a 35 °C.
• Odpovědi:
  
  • Rozlišení monomer–HMWs (Rs).
  • Procento agregátů HMWs (%).
  • Šířka hlavního píku (w1/2).
• Instrumentace:
  
  • LC systém ACQUITY H-Class Bio Plus (quaternární).
  • Kolona XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2.5 µm, 4.6×150 mm.
  • Detekce UV při 280 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza faktoriálního designu ukázala, že nejvýznamnějším parametrem ovlivňujícím obnovu agregátů a tvar píků je síla pufru (iontová síla). Přidání metanolu mělo menší vliv a vliv teploty byl zanedbatelný. Lineární model predikoval hodnotu procenta HMWs s odchylkou menší než 1 %, což potvrzuje vhodnost zvoleného přístupu. Optimalizované podmínky (1× PBS, 0 % organického modifikátoru, 35 °C) vedly k maximální obnově a nejostřejším píkům. Zvýšení průtoku na 0.7 mL/min umožnilo zkrátit dobu analýzy při zachování rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný postup nabízí:

• Rychlé zjištění ideálních podmínek pomocí 8 měření za méně než dvě hodiny.
• Predikci kvality separace pro libovolné kombinace faktorů.
• Možnost akcelerace analýzy zvýšením průtoku.
• Vhodnost pro různé proteiny a biologické léky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření DoE o další faktory jako pH či charakter stacionární fáze.
• Automatizace výpočtů a vizualizace výsledků v Excelu či specializovaném softwaru.
• Integrace s on-line monitorováním pro real-time optimalizaci metod.
• Využití nových materiálů stacionární fáze pro snížení sekundárních interakcí.

Závěr

Navržený systémový přístup založený na plném faktoriálním designu 2³ umožňuje rychlou a efektivní optimalizaci SEC metod pro proteiny. Lineární model spolehlivě predikuje klíčové odpovědi a zvolený postup výrazně zkracuje dobu vývoje metod.

Reference

1. P. Hong et al., Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 35 (2012) 2923–2950.
2. S. Fekete et al., Investigating the Secondary Interactions of Packing Materials for Size-Exclusion Chromatography of Therapeutic Proteins, J. Chromatogr. A 1676 (2022) 463262.
3. S. Fekete et al., Theory and Practice of Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Aggregates, J. Pharm. Biomed. Anal. 101 (2014) 161–173.
4. R.D. Ricker, L.A. Sandoval, Fast, Reproducible Size-Exclusion Chromatography of Biological Macromolecules, J. Chromatogr. A 743 (1996) 43–50.
5. M. Kamberi et al., Analysis of Non-covalent Aggregation of Synthetic hPTH (1–34) By Size-Exclusion Chromatography, J. Chromatogr. B 810 (2004) 151–155.
6. A.M. Striegel et al., Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, John Wiley & Sons Inc., 2009.
7. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Phosphate Buffered Saline (PBS) Recipe, 2006.