Size-Exclusion Chromatography Analysis of Adeno-Associated Virus (AAV) Preparations Using a 450 Å Diol-Bonded BEH Column and Fluorescence Detection

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) představuje klíčový vektor v oblasti genové terapie. Kvalitativní a kvantitativní sledování agregátů (HMWS) a fragmentů (LMWS) má zásadní vliv na bezpečnost a účinnost klinických přípravků. Metody velikostně vylučovací chromatografie (SEC) pod ne-denaturačními podmínkami umožňují rychlou charakterizaci těchto strukturálních forem.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat SEC separaci různých serotypů AAV (1, 2, 5, 6, 8, 9) za použití BEH diol-vazebného sloupce s průměrem pórů 450 Å a detekcí založenou na intrinsické fluorescenci. Studie se zaměřila na:

• Oddělení monomerů, dimerů a nižších multimerních forem AAV
• Detekci nízkomolekulárních fragmentů
• Minimalizaci objemu vzorku a zlepšení poměru signál/šum

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s FLR detektorem
• XBridge Protein BEH SEC Columns, 450 Å, 3,5 µm, 7,8×300 mm
• ACQUITY FLR Detector (excitace 280 nm, emise 350 nm)
• Wyatt microDAWN MALS detektor
• Waters ACQUITY RI Detector
• Empower 3 software s Auto•Blend Plus Technology
• BEH450 SEC Protein Standard Mix se 10 µg/mL L-tryptofanu jako značka objemu eluce

Metodika

Mobilní fáze složena z fosfátového pufru (10 mM NaH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 6,6) s varováním koncentrace KCl (150–400 mM podle serotypu). Průtok 0,6 mL/min, teplota kolony 25 °C, autosamplery při 6 °C, injekční objem ~5–10 µL. K optimalizaci pH a iontické síly byla použita jednofaktorová strategie s Auto•Blend Plus. Kontrola separace byla prováděna s MALS a RI detekcí.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala:

• Dobrou rozlišitelnost monomerů (~25 nm), dimerů a multimerů AAV pod 100 nm.
• Variabilní koncentrace KCl pro maximální návratnost a symetrické tvary píků pro jednotlivé serotypy (např. 200 mM pro AAV1, 350 mM pro AAV2 a AAV6, 400 mM pro AAV8).
• Detekce LMW fragmentů značná pouze u AAV9 (~0,8 %) a ve stopovém množství u AAV6.
• Intrinsic fluorescence zvýšila citlivost, eliminovala závislost signálu na obsahu DNA oproti UV.
• Přidání L-tryptofanu umožnilo spolehlivou identifikaci celého průtoku kolony.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rutinní kontrolu kvality AAV přípravků ve výrobních i výzkumných laboratořích. Nízký požadavek na objem vzorku a vysoká citlivost fluorescenční detekce podporují analýzy vzácných nebo nízkokoncentrovaných vzorků. Optimalizace iontické síly zajišťuje spolehlivé kvantifikace agregátů i fragmentů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření kombinace SEC s hmotnostní spektrometrií nebo pokročilou světelnou spektroskopií pro detailnější charakterizaci struktury AAV. Integrace s capillary electrophoresis a mikrofluidními platformami může zkrátit časy analýz a snížit spotřebu vzorku. Plně faktorová optimalizace metod (DoE) zajistí robustnější podmínky pro různé serotypy.

Závěr

BEH diol-vazebný sloupec s pory 450 Å a intrinsic fluorescence detekce představuje efektivní řešení pro charakterizaci AAV včetně HMWS a LMWS. Metoda je robustní, citlivá a snadno implementovatelná do QA/QC procesů genové terapie.

Reference

1. Wright J. F. Manufacturing and Characterizing AAV-Based Vectors for Use in Clinical Studies. Gene Therapy. 2008, 15, 840–848.
2. Vernon S.; Stasny J.; Neurath A.; Rubin B. Electron Microscopy of DNA from Adeno-Associated Virus Type I. Journal of General Virology. 1971, 10, 267–272.
3. Carpenter J. F.; Randolph T. W.; Jiskoot W.; Crommelin D. J.; Middaugh C. R.; Winter G.; et al. Overlooking Subvisible Particles in Therapeutic Protein Products: Gaps that May Compromise Product Quality. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2009, 98, 1201–1205.
4. Slutter B.; Jiskoot W. Sizing the Optimal Dimensions of a Vaccine Delivery System: a Particulate Matter. Expert Opinion on Drug Delivery. 2016, 13, 167–170.
5. Wang C.; Mulagapati S. H. R.; Chen Z.; Du J.; Zhao X.; Xi G.; et al. Developing an Anion Exchange Chromatography Assay for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV6.2. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 2019, 15, 257–263.
6. Warren W.; Astephen N. E.; Wheat T. E. Systematic Optimization of Protein Separations on High-Performance Ion-Exchange Chromatographic Media. J. Chromatogr. A. 1990, 512, 13–22.