IMSC: Complete Characterization of a Cysteine- linked Antibody-Drug Conjugate Performed on a Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with High Mass Range

Význam tématu

Metody netargetované label-free kvantifikace umožňují stanovení relativní abundancí proteinů bez použití izotopických značek. Pro analytickou komunitu je klíčové rozšířit nástroje pro přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci v komplexních biologických vzorcích. Nová verze Proteome Discoverer 2.2 přináší plnohodnotné řešení, které dříve bylo vyhrazeno pouze izotopicky značeným metodám.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo navrhnout, implementovat a otestovat nový uzlově řízený workflow pro netargetovanou label-free kvantifikaci v Proteome Discoverer 2.2. Tento workflow kombinuje rozšířenou detekci funkcí, zarovnání retenčního času a konsenzuální mapování napříč vzorky. Byla provedena srovnávací analýza s existujícími přístupy spectral counting a průměrování top N peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Byly využity dvě referenční datové sady z repozitáře PRIDE:

• Spike-in dataset Arabidopsis proteasomu v pozadí Escherichia coli (PXD003002).
• Část lidského proteomu od Pandey et al., pro multidimenzionální separaci.

Analýzy proběhly na hybridním kvadrupól-Orbitrap hmotnostním spektrometru s vysokým hmotnostním rozsahem. Software Proteome Discoverer 2.1 a předpremiérová verze 2.2 s uzly Sequest HT-Percolator, Precursor Ion Area Detector, Minora Feature Detector, Rt-Aligner, Feature Mapper a Peptide and Protein Quantifier.

Hlavní výsledky a diskuse

Nový algoritmus Minora detekuje a kvantifikuje izotopické funkce bez závislosti na přiřazení k PSM. Konsenzuální workflow provádí:

• Zarovnání retenčního času mezi jednotlivými běhy.
• Skupinování funkcí do konsenzuálních entit a doplňování chybějících hodnot (gap filling).
• Vypočet poměrů, škálovaných abundancí a statistických chyb.

Porovnání s metodami spectral counting a Top N prokázalo vyšší přesnost i u vysoce komplexních datasetů.

Přínosy a praktické využití metody

Nový workflow poskytuje:

• Možnost poměrové kvantifikace a výpočtu standardních odchylek.
• Zvýšené proteomické pokrytí a reprodukovatelnost dat.
• Flexibilní integraci do QA/QC procesů v průmyslové a klinické proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření pro datově nezávislou akvizici (DIA), automatizaci a využití strojového učení pro pokročilou detekci funkcí. Integrace do multi-omics platforem a cloudové zpracování dat posílí kapacitu velkých projektů.

Závěr

Proteome Discoverer 2.2 přináší netargetovanou label-free kvantifikaci s plnou sadou nástrojů dříve vyhrazených izotopickým metodám. Workflow zlepšuje přesnost, rozšiřuje analytické možnosti a usnadňuje robustní proteomické studie bez nutnosti značení.

Reference

1. Dataset PXD003002: Arabidopsis proteasomu spike-in dataset, PRIDE repository.
2. Pandey A. et al., A draft map of the human proteome. Nature, 2014; data z PRIDE repository.