IMSC: New Method for Label-Free Quantication in the Proteome Discoverer Framework

Význam tématu

Metody bezznačkového kvantifikování proteinů hrají klíčovou roli v proteomických studiích, kde je nutné přesně a spolehlivě měřit relativní množství proteinů bez použití izotopických značek. Moderní softwarová řešení umožňují analyzovat komplexní LC–MS/MS data a poskytovat informaci o změnách exprese proteinů v biologických vzorcích.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo představit a otestovat novou bezznačkovou kvantifikační metodu založenou na algoritmu Minora implementovaném v rámci Proteome Discoverer™ 2.2 a porovnat ji s existujícími přístupy Spectral Counting a Top N.

Použitá metodika a instrumentace

Pro zpracování dat byla využita platforma Thermo Fisher Scientific Proteome Discoverer 2.2 s těmito klíčovými moduly:

• Sequest HT s Percolator filtrem pro identifikaci peptidů
• Precursor Ion Area Detector pro detekci a kvantifikaci prekurzorových iontů
• Minora Feature Detector pro detekci izotopických shluků
• Rt-Aligner pro zarovnání retenčního času mezi běhy
• Feature Mapper pro vytvoření konsenzuálních funkcí (Consensus Features)
• Peptide and Protein Quantifier pro výpočet množství na úrovni peptidů a proteinů

Datové sady zahrnovaly standard Arabidopsis proteazomu v pozadí proteinu E. coli a subset lidského proteomu (Pandey dataset). Pro test multi-dimenzionálního LC profilování byly analyzovány frakce mozkových vzorků.

Hlavní výsledky a diskuse

Nová bezznačková metoda založená na Minora algoritmu prokázala oproti Spectral Counting i Top N významně lepší přesnost (průměrné odchylky referenčních poměrů byly blíže očekávaným hodnotám) a lepší citlivost (vyšší počet kvantifikovaných proteinů díky nižšímu počtu nutných PSM). Metoda navíc využívá normalizaci vůči konstantnímu množství E. coli proteinů, čímž se zlepšuje stabilita výsledků.
V případě multi-dimenzionálního LC profilování lidských vzorků byly identifikovány tisíce proteinů a unikátních peptidů. Při třídění podle škálovaného množství v rámci jednotlivých vzorků bylo možné vyzdvihnout proteiny specifické pro frontální kortex, mezi něž patří synapsiny a tau protein, jejichž absence signálu v ostatních vzorcích potvrzuje správnost mapování funkcí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Přesné kvantitativní srovnání vzorků bez nutnosti chemického značení
• Detekci i nízkomolekulárních změn díky vyšší senzitivitě
• Flexibilní normalizaci na referenční proteiny
• Integraci do stávajících pracovních postupů v Proteome Discoverer

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný další vývoj zahrnuje implementaci kvantifikace pomocí emPAI a dalších bezznačkových metrik, rozšíření podpory víceúrovňových frakcí a vývoj automatických modulů pro zpracování rozsáhlých klinických a biologických kohort.

Závěr

Popsaná bezznačková kvantifikace založená na Minora algoritmu představuje významný krok vpřed v analýze proteomických dat. Spojení pokročilého detekčního algoritmu s robustními nástroji pro zarovnání a normalizaci ve frameworku Proteome Discoverer 2.2 nabízí vědcům přesnou a citlivou metodu pro množstevní analýzu proteinů v širokém dynamickém rozsahu.

Reference

• Gemperline D. C. et al. Proteomics, 16, 920–924 (2016).
• Kim M.-S. et al. Nature, 509, 575–581 (2014).