New Method for Label-Free Quantification in the Proteome Discoverer Framework

Význam tématu

V proteomice je kvantifikace proteinů klíčová pro pochopení biologických procesů, od identifikace biomarkerů až po kontrolu kvality ve farmacii a potravinářství. Label-free metody nabízejí flexibilitu bez nutnosti označování vzorků, ale dosud měly omezenou přesnost a citlivost ve srovnání s izotopově značenými přístupy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit novou workflow pro untargeted label-free kvantifikaci v platformě Proteome Discoverer založenou na rozšířeném algoritmu Minora. Workflow bylo testováno na standardním datasetu Arabidopsis proteasomu spikovaném do E. coli pozadí a na částech lidského proteomu (Pandey dataset), a porovnáno s klasickými label-free přístupy: spectral counting a Top N.

Použitá metodika a instrumentace

• Workflow postavené na Proteome Discoverer 2.2: uzly Minora Feature Detector, Rt-Aligner, Feature Mapper a Consensus workflow.
• Spectrometrie: LC-MS/MS analýza s následným Sequest HT-Percolator vyhledáním proti databázím Arabidopsis thaliana a Escherichia coli.
• Porovnávací metody: spectral counting (Sum PSM), Top N Peptides (Top 3) a nová detekce rysů (feature detection).
• Manuální výpočet poměrů a vizualizace škálovaných abundancí v Excelu.
• Multi-dimenzionální separace pro frakce lidského proteomu (frakce 11–15).

Hlavní výsledky a diskuse

Nový algoritmus feature detection vykázal výrazně lepší přesnost napříč dynamickým rozsahem ve srovnání se spectral counting a Top N: průměrné poměry Arabidopsis proteinů se blížily očekávaným hodnotám a standardní odchylky byly nižší. Škálované abundance ukázaly konzistentní trend bez potřeby výpočtu poměrů. Při analýze multi-dimenzionálního lidského proteomu bylo identifikováno 5116 proteinů a 60616 peptidů, přičemž neural-specifické proteiny se jasně odlišily v řadě frakcí.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované zpracování kvantifikace, normalizace a reportingu v Proteome Discoverer šetří čas a eliminuje chyby při manuálních výpočtech.
• Škálovaná abundance usnadňuje vizualizaci a interpretaci dat bez nutnosti poměrových výpočtů.
• Workflow podporuje jak jednorozměrné, tak vícefázové LC-MS/MS experimenty, což ocení výzkumná i QA/QC pracoviště.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nástroje o metody zlepšeného spectral counting (např. emPAI) a integrace do dalších softwarových platforem. Dalším krokem je automatizace gap fillingu a podpora pro nové instrumentální technologie, včetně vysoce rozlišených masovacích analyzátorů. Kombinace s AI/ML přístupy může dále zvýšit výkonnost a interpretovatelnost label-free dat.

Závěr

Nová metoda untargeted label-free kvantifikace založená na Minora algoritmu v Proteome Discoverer 2.2 prokázala vyšší přesnost, citlivost a reprodukovatelnost než dosavadní label-free přístupy. Integrované workflow poskytuje robustní řešení pro analýzu komplexních proteomických dat.

Reference

• Gemperline DC et al. Proteomics, 16, 920–924 (2016).
• Kim M.-S. et al. Nature, 509, 575–581 (2014).