IMSC: Development of an All-Recombinant Intact Protein Standard for LC-MS Application Development and System Suitability Testing

Význam tématu

Analýza intact proteinů představuje klíčový pilíř pro top-down proteomiku a vyžaduje robustní referenční standardy pro kontrolu kvality (QC) chromatografických a hmotově spektrometrických metod. Díky neustálému zdokonalování LC a MS instrumentace a softwaru pro sběr i zpracování dat se otevírá možnost spolehlivě sledovat výkon analytických platforem v čase a mezi laboratořemi.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout plně rekombinantní intact protein standard, který:

• pokrývá molekulární hmotnostní rozsah 12–66 kDa,
• generuje čisté, modifikacemi i adukty neovlivněné ESI spektra,
• zajišťuje rovnoměrné rozložení nábojových stavů v m/z 500–2000,
• vychází z volně dostupných proteinů produkovaných v bakteriálních systémech,
• má vynikající teplotní i časovou stabilitu pro QC LC, LC-MS a LC-MS/MS.

Použitá metodika

Rekombinantní proteiny byly exprimovány v Escherichia coli a Bacillus subtilis. Po transformaci a kultivaci následovala buněčná lýza, trojí chromatografická purifikace, dialýza, desalting a lyofilizace. Pro výběr konečné sedmičky kandidátů byly využity:

• infuzní ESI-MS k posouzení ionizace a distribuce nábojových stavů,
• LC-MS a UV HPLC pro kontrolu čistoty a chromatografické chování,
• SDS-PAGE pro vizuální ověření homogenity směsi,
• MS/MS (HCD) pro potvrzení aminokyselných sekvencí.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Q Exactive hybridní kvadrupól-Orbitrap™ MS
• Thermo Scientific Q Exactive HF orbitrap MS
• Thermo Scientific Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ MS
• Thermo Scientific UltiMate™ 3000 RSLCnano System
• ProSwift™ RP-4H LC kolona (200 µm × 25 cm) a MAbPac RP (2,1 mm × 50 mm)
• UV detekce při 214 nm a 280 nm

Hlavní výsledky a diskuse

Ze sedmi původních komerčních proteinů (cytochrom c, RNáza A, myoglobin, inhibitor trypsinu, karbonická anhydráza, enoláza, albumin) byly vybrány kandidáty a jejich ekvivalenty vyrobené rekombinantně. Infuzní spektra při 140 000 a 8 000 rozlišení potvrdila detekci 12–66 kDa. SDS-PAGE a UV-HPLC demonstrovaly vysokou homogenitu a dobrou chromatografickou separaci. HCD MS/MS ověřilo přiřazení sekvencí. Předběžné testy stability po 7 dnech při 37 °C prokázaly zachování signálů, což naznačuje dlouhodobou skladovatelnost při −20 °C.

Přínosy a praktické využití metody

Standard nabízí:

• reprodukovatelnou QC směs pro optimalizaci a validaci top-down proteomických protokolů,
• možnost normalizace výkonu LC-MS/MS platforem mezi laboratořemi,
• vyloučení živočišných komponent a tím i rizika variability a regulačních omezení,
• podporu vývoje metod pro farmaceutický průmysl, klinické proteomické aplikace a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se:

• rozšíření panelu o další proteiny pro širší m/z a funkční pokrytí,
• implementace do automatizovaných QC workflow,
• rovnoměrná mezi-laboratorní validace a standardizace měření,
• využití v regulovaných laboratořích a multiparametrických omics studiích,
• další vývoj směsí pro specifické aplikace (např. PTM štěpení, studium konformací).

Závěr

Byl vytvořen plně rekombinantní intact protein standard splňující požadavky na čistotu, stabilitu a rozsah molekulových hmotností i m/z vhodný pro QC LC, LC-MS a LC-MS/MS experimentů. Je kompatibilní s průmyslovými i klinickými aplikacemi a přispívá k robustní a normalizované proteomické analýze.