Optimizing Top Down Analysis of Proteins on Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Top-down analýza intact proteinů umožňuje přímé stanovení jejich hmotnosti i lokalizaci post-translačních modifikací a proteoform. V praxi to usnadňuje komplexní charakterizaci proteinu včetně přirozených modifikací, což je nezbytné v biotechnologickém vývoji, základním výzkumu i kvalitativní/kvantitativní kontrole farmaceutických bílkovin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo optimalizovat top-down metody na hybridním Orbitrap Fusion Lumos spektrometru tak, aby se maximalizovalo pokrytí sekvence intact proteinů. Autoři se zaměřili na srovnání standardních ETD, HCD a CID fragmentací s novým režimem ETD High Dynamic range (ETD HD) a na aplikaci jak přímé infuze, tak LC-MS analýzy na bodech typických standardů (Ubiquitin, Carbonic anhydrase, Enolase, IgG) a rekombinantní extracelulární domény trop2.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přímou infuzi a LC-MS analýzu byly použity tyto přístroje:

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (Thermo Scientific) v režimu intact protein s ETD HD, ETD, HCD a CID fragmentací
• UltiMate 3000 RSLCnano systém v mikroflow režimu
• ProSwift monolitická kapilární kolona (200 µm × 25 cm) s gradientem 25–65 % acetonitrilu/0,1 % kyseliny formiové
• TCEP redukce a PNGase F pro odštěpení N-glykosidových vazeb u trop2
• ProSightPC 3.0 SP1 software s tolerancí ±15 ppm pro fragmentní ionty

Hlavní výsledky a diskuse

Autoři prokázali, že ETD HD režim významně zlepšuje pokrytí sekvence:

• Ubiquitin: 76 % (ETD HD) vs. 65 % (klasické ETD)
• Carbonic anhydrase: dosaženo přes 68% v LC-MS experimentu za zkráceného času
• Enolase: 41% sekvenční pokrytí v online LC-MS
• IgG lehký řetězec (direct infusion): 56 % (ETD HD) vs. 48 % (ETD)
• Kombinací ETD HD, HCD a CID pro IgG lehký řetězec: 91 % sekvence, pro těžký řetězec: 63 %
• Trop2: identifikována přetruncovaná N-terminální oblast (residua 1–30 místo predikovaných 1–26), pyroglutamátová konverze N-terminálního glutaminu a deamidace tří Asn zbytků
• Intakt IgG LC-MS ETD HD: 20 % (lehké) a 18 % (těžké řetězce) pokrytí při 120 K

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace ETD HD na Orbitrap Fusion Lumos přináší:

• Vyšší dynamický rozsah fragmentace intact proteinů
• Rychlejší akvizici fragmentačních dat
• Video sled sekvenčního pokrytí i u vysoce heterogenních bílkovin (IgG, glykoproteiny)
• Lepší identifikaci post-translačních modifikací přímo na intact proteinu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Dynamické kombinace fragmentačních technik pro zlepšení citlivosti a pokrytí
• Využití vyššího tlaku v iontovém routing multipólu pro těžké proteiny a komplexní proteoformy
• Automatizované workflow a pokročilá softwarová řešení pro rychlejší datovou analýzu
• Implementace top-down metod v průmyslové kontrole biotechnologií a farmacie

Závěr

Studie ukazuje, že režim ETD HD na Orbitrap Fusion Lumos významně zvyšuje sekvenční pokrytí intact proteinů při zachování rychlých akvizičních časů. Kombinace ETD HD s HCD a CID a aplikace LC-MS přináší robustní platformu pro detailní charakterizaci proteoform, včetně detekce truncací a modifikací.

Reference

• Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer, Product Specifications
• C. Mullen et al., Considerations for Attaining Improved ETD Performance for Top Down Applications, Poster 48, 6/2
• J. Canterbury et al., Improvements for high-resolution analysis on a modified Tribrid mass spectrometer, Poster 124, 6/2