High-sensitivity low-nano flow LC-MS methods for high-throughput sample-limited proteomics

Význam tématu

Analytika vzorků s velmi nízkým množstvím proteinů, jako jsou jednotlivé buňky, vyžaduje metody s vysokou citlivostí a zároveň dostatečnou propustností. Spojení nízkoproudé nano-LC separace se špičkovým Orbitrap MS přístrojem otevírá cestu k hluboké proteomické analýze subnanogramových vzorků při zachování robustnosti a opakovatelnosti měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je představit pět optimalizovaných LC-MS metod, které využívají kolonu o vnitřním průměru 50 µm při průtoku 100 nL/min na systému Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC spárovaném s Orbitrap Exploris™ 480. Metody jsou navrženy pro přímou injekci a kombinují krátké gradienty (10–50 min) pro vyvážení citlivosti a propustnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: HeLa digest připravený v 0,1 % kyselině mravenčí, 1 ng/µL koncentrace.
• UHPLC: Vanquish Neo se systémem Binary Pump N, Split Sampler NT, nízkým GDV (<300 nL).
• Kolona: Acclaim PepMap 100 C18, 50 µm × 150 mm, 2 µm dp, 10 µm nanoemiter.
• MS: Orbitrap Exploris 480 s FAIMS Pro, režimy DDA a DIA.
• Softwarové nástroje: Proteome Discoverer 3.0 (SEQUEST HT + INFERYS), CHIMERYS, Spectronaut 17.

Hlavní výsledky a diskuse

• V DDA režimu na 10 min gradientu bylo identifikováno ~1 500 proteinových skupin z 250 pg vzorku (SEQUEST + INFERYS) a >1 800 proteinů (CHIMERYS).
• DIA strategie s 10–12 m/z okny umožnila detekci >3 000 proteinových skupin z 250 pg, pokrývajícím>4 řády dynamického rozmezí.
• Metody s gradienty 10, 14, 20, 30 a 50 min dosahují denní propustnosti 24–72 vzorků s MS využitím 55–85 %.
• Výborná reprodukovatelnost retencí (<6 s) a kvantitativní variace proteinů (<20 % CV).

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow podporuje vysokopropustné analýzy vzorků s nízkým obsahem proteinů, včetně single-cell proteomiky (SCP). Umožňuje také snadné rozšíření na multiplexní kvantifikaci (např. TMT) pro větší experimentální série.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších AI-řízení pro rozpoznávání spekter a dekonvoluci chimerických signálů.
• Další miniaturizace LC systému a kolony pro zlepšení citlivosti.
• Automatizované workflow pro klinické a diagnostické aplikace na úrovni jednotlivých buněk.
• Rozšíření metod na další typy vzorků s omezeným množstvím (biopsy, kapilární krev).

Závěr

Předložené nano-LC-MS metody dosahují špičkové citlivosti i propustnosti při analýze subnanogramových vzorků. Kombinace optimalizovaných gradientů, nízkého GDV a pokročilých softwarových algoritmů poskytuje robustní platformu pro sapmle-limited proteomiku s možností dalšího rozšíření pro multiplexní kvantifikaci.

Reference

1. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2020.
2. Stejskal K.; Op de Beeck J. et al. Ultrasensitive NanoLC-MS of Subnanogram Protein Samples Using Second Generation Micropillar Array LC Technology with Orbitrap Exploris 480 and FAIMS PRO. Anal. Chem. 2021, 93 (25), 8704–8710.