Isocratic Separation of RNA Nucleotide Triphosphates Including Pseudouridine using an Atlantis Premier BEH Z-HILIC Column

Význam tématu

V posledních letech se syntetická RNA, zejména mRNA, prosadila jako klíčový nástroj pro vývoj terapeutik a vakcín, např. proti SARS-CoV-2. Kvalita výchozích nukleotidů zásadně ovlivňuje efektivitu a spolehlivost mRNA syntézy. Zároveň se triphosfáty mohou během skladování či přípravy rozkládat na di- a monofosfáty, což může vést k nevyhovujícím výsledkům. Spolehlivé analytické metody pro oddělení a detekci těchto látek proto hrají v praxi zásadní roli.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout rychlou isokratickou metodu na separaci čtyř hlavních RNA nukleotidových triphosfátů (ATP, CTP, GTP, UTP) a modifikovaného pseudouridin-triphosfátu (pUTP). Metoda využívá kolonku Atlantis Premier BEH Z-HILIC a jednoduché pufrované mobilní fáze, optimalizované pro krátký analytický cyklus a kompatibilitu s UV i MS detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky nukleotidů byly připraveny v acetonitrilu s 7–30 % vodné složky podle druhu látky, finální směs obsahovala 50 µg/mL každého nukleotidu v poměru 90:10 acetonitril:voda. Pseudouridin-triphosfát byl aplikován samostatně.

• LC systém: ACQUITY UPLC H-Class PLUS s QSM, SM-FTN, Column Manager, PDA detektorem
• Kolonka: Atlantis Premier BEH Z-HILIC, 2,1×100 mm, 2,5 µm
• Mobilní fáze: 70:30 v/v acetonitril:20 mM ammonium acetát (pH 9,0)
• Teplota kolony 20 °C, vzorku 10 °C, průtok 0,2 mL/min, detekce UV 260 nm
• Software: Empower 3 FR4

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace probíhala ve třech krocích: odstranění metanolu pro lepší tvar píků CTP a GTP, zvýšení podílu vody z 25 % na 30 % pro kratší retence a finální snížení průtoku na 0,2 mL/min pro maximální rozlišení pUTP/UTP. Všechny pět analyzátů bylo dosaženo v rámci 15 min s baseline separací a dostatečnou citlivostí pro detekci degradantů (di-/monofosfátů).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a jednoduchá QC analýza nukleotidů před mRNA syntézou
• Bez ion-pair činidel vhodná pro LC–MS
• Vysoká citlivost a čistý tvar píků díky technologii MaxPeak Premier HPS
• Jednoduchá příprava mobilní fáze a reproducibilita měření

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro přesné rozeznání izobarických sloučenin
• Rozšíření metodiky na jiné nukleotidy či modifikace RNA
• Automatizace a online monitorování stability nukleotidů
• Vývoj multidimenzionálních chromatografických přístupů pro komplexní analýzu nativních i modifikovaných ribonukleotidů

Závěr

Je vyvinuta robustní HILIC metoda pro separaci čtyř hlavních RNA triphosfátů a pseudouridin-triphosfátu s vysokou účinností, rychlostí (<15 min) a vhodností pro UV i MS detekci. Metoda umožňuje spolehlivou QC výchozích nukleotidů v syntetických pracovištích.

Reference

1. Xu S, Yang K, Li R, Zhang L. mRNA Vaccine Era–Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection. Int J Mol Sci. 2021;22:6582.
2. Werner A. Reversed-phase and Ion-Pair Separations of Nucleotides, Nucleosides, and Nucleobases: Analysis of Biological Samples in Health and Disease. J Chromatogr B. 1993;619:3–14.
3. Yang FQ, Li DQ, Feng K, Hu DJ, Li SP. Determination of Nucleotides, Nucleosides and Their Transformation Products in Cordyceps by Ion-Pairing RP-LC-MS. J Chromatogr A. 2010;1217:5501–5510.
4. Smith K, Rainville P. Utilization of MaxPeak High Performance Surfaces and the Atlantis Premier BEH C18 AX Column to Increase Sensitivity of LC-MS Analysis. Waters Appl Note. 2020;720006745.
5. Walter TH et al. Modifying the Metal Surfaces in HPLC Systems and Columns to Prevent Analyte Adsorption and Other Deleterious Effects. LCGC. 2022;40(6):28–34.