Improved Separation of RNA Nucleotides, Nucleosides, and Nucleobases on Atlantis Premier BEH Z-HILIC Columns

Význam tématu

Analýza RNA komponent je klíčová v metabolomice, potravinářských testech a environmentálním monitoringu. Nukleobáze, nukleosidy a nukleotidy slouží jako biomarkery a důležité biologické stavební kameny. Jejich vysoká polarita omezuje použití reverzní fáze LC bez iontově–párovacích činidel, což zhoršuje MS detekci.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat čtyři HILIC stacionární fáze pro separaci třinácti strukturálně podobných RNA komponent v jednom analytickém běhu. Zaměřili jsme se na jedinečnou selektivitu kolon BEH Z-HILIC od Waters a optimalizovali metodiku na ACQUITY Premier systému s Xevo TQD detekcí.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: ACQUITY Premier s Quaternary Solvent Manager, 2.1×50 mm kolony, teplota 50 °C, tok 0,5 mL/min, inj. objem 0,5 µL
• Kolony: ACQUITY UPLC BEH Amide; Atlantis Premier BEH Z-HILIC; Competitor A HILIC-z; Competitor B Polar X
• Mobilní fáze: voda (A), acetonitril (B), 200 mM ammonium formátu pH 3,0 (D); gradient 5→40 % A, 10→50 mM formátu
• MS: Xevo TQD, MRM v pozitivním i negativním režimu, specifické capilární a kolizní energie dle analyzátu
• Vzorky: 13 RNA komponent v 50:50 acetonitril:voda s 0,1 % kyseliny mravenčí
• Software: MassLynx v4.2

Hlavní výsledky a diskuse

Atlantis Premier BEH Z-HILIC byla jediná kolona schopná rozdělit všech třináct analyzátů bez koelucí. Ostatní fáze vykazovaly minimálně jednu spárovanou eluci. Rozdíly v retenčním chování a selektivitě jsou důsledkem odlišné chemie ligandů a typu částice (plně pórové BEH vs superficially porous a mixed-mode). BEH Z-HILIC přinesla až o 30 % užší píky nukleotidů než BEH Amide a o 60 % užší než konkurenční fáze díky technologii MaxPeak HPS, která omezila nežádoucí interakce s kovovým hardwarem.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní separace třinácti biologicky relevantních RNA komponent
• Vysoká selektivita díky unikátní chemii BEH Z-HILIC
• Vylepšené tvary píků nukleotidů pro citlivější detekci
• Rychlý a robustní průběh analýzy na 50 mm kolónách
• Aplikace v metabolomice, potravinové kvalitě, QA/QC a biomarkerové identifikaci

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace stacionárních fází pro zvýšení selektivity
• Integrace s ultrarychle systémy a vyšším rozlišením
• Rozšíření analýzy na modifikované nukleotidy a onkomarkery
• Miniaturizace a multiplexní analýzy pro vysokopropustné workflow

Závěr

Atlantis Premier BEH Z-HILIC ve spojení s ACQUITY Premier systémem umožnila plné oddělení třinácti RNA komponent v jedné analýze, přičemž technologie MaxPeak HPS výrazně zlepšila tvar píků nukleotidů. Metoda je rychlá, robustní a vysoce selektivní pro širokou škálu biologických i průmyslových aplikací.

Reference

1. Inoue K., Obara R., Hino T., Oka H.: Development and Application of an HILIC-MS/MS Method for the Quantitation of Nucleotides in Infant Formula. J. Agric. Food Chem. 2010, 58(18):9918–9924.
2. Logotheti M., Theochari K., Kostakis M., Pasias I., Thomaidis N.: Development and Validation of a HILIC–UV Method for the Determination of Nucleotides in Fish Samples. Food Chem. 2018, 248:70–77.
3. Mateos-Vivas M., Rodriguez-Gonzalo E., Domingues-Alvarez J., Garcia-Gomez D., Carabias-Martinez R.: Determination of Nucleosides and Nucleotides in Baby Food by HILIC–MS/MS in the Presence of Hydrophilic Ion-Pairing Reagents. Food Chem. 2016, 211:827–835.
4. Zhao H., Wang X., Li H., Yang B., Yang H., Huang L.: Characterization of Nucleosides and Nucleobases in Natural Cordyceps by HILIC-ESI/TOF/MS and HILIC-ESI/MS. Molecules 2013, 18(8):9755–9769.
5. Chen P., Li W., Li Q., Wang Y., Li Z., Ni Y., Koike K.: Identification and Quantification of Nucleosides and Nucleobases in Geosaurus and Leech by HILIC. Talanta 2011, 85(3):1634–1641.
6. Jung M., Lauber M.: Demonstrating Improved Sensitivity and Dynamic Range with MaxPeak HPS Technology: A Case Study on the Detection of Nucleotides. Waters Application Note 2020.