Application Note Separation of Pentose Phosphate Pathway, Glycolysis, and Energy Metabolites Using an ACQUITY Premier System With an Atlantis Premier BEH Z-HILIC Column

Význam tématu

Analýza metabolitů centrálního metabolismu, zejména glykolýzy, pentózového fosfátového cyklu a energetických nukleotidů, je klíčová pro studium buněčného energetického stavu, redoxní homeostázy a patofyziologie řady onemocnění. Tyto látky jsou vysoce polarizované a obsahují fosfátové skupiny, což vede k jejich nepříznivým interakcím s kovovými povrchy v konvenčních kapalinových chromatografických systémech. Výsledkem těchto interakcí jsou roztažené nebo asymetrické chromatografické píky, nízká citlivost a špatná reprodukovatelnost měření.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout robustní, cílenou UPLC-MS/MS metodiku pro separaci a kvantifikaci 27 metabolitů glykolýzy, pentózového fosfátového cyklu a energetických nukleotidů v plazmě a tkáňových extraktech. Studie demonstruje využití technologie MaxPeak High Performance Surfaces v kombinaci s novou Atlantis Premier BEH Z-HILIC kolonkou na systému ACQUITY Premier a tandemovým kvadrupólovým hmotovým spektrometrem Xevo TQ-S micro.

Použitá metodika

Pro separaci byl optimalizován pufrovací roztok 15 mM amonného hydrogenuhličitanu pH 9, který poskytl ostré a symetrické píky. Vzorky plazmy, jater a mozku potkanů se připravily srážením v 80 % methanolu, následnou homogenizací a odpařením. Reflux vzorků se rekonstituoval v 50 % acetonitrilu. Chromatografie probíhala na 2,1×100 mm kolonce s částicemi 1,7 µm při teplotě 30 °C, průtoku 0,5 ml/min a injekčním objemu 3 µl. MS/MS detekce využila pozitivní i negativní elektrosprejovou ionizaci s optimalizovanými parametry kapilárního napětí, teploty a toků pomocných plynů.

Použitá instrumentace

• ULPLC systém ACQUITY Premier s MaxPeak HPS technologií
• Atlantis Premier BEH Z-HILIC kolonka 1.7 µm, 2.1×100 mm
• Tandemový kvadrupólový MS Xevo TQ-S micro
• Software MassLynx v4.2 SCN1017

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pH mobilní fáze odhalila významný zlepšený tvar píků pro fosforylované metabolity při pH 9.0, což potvrdily komparativní testy s pH 5.0 a 6.8. Porovnání pufrů amonného acetátu a hydrogenuhličitanu ukázalo, že hydrogenuhličitan zlepšuje rozlišení isobarických párů (ribóza-5-fosfát vs. ribulóza/xylulóza-5-fosfát, 2-PG vs. 3-PG). Zvýšení koncentrace pufru z 5 na 15 mM prodloužilo retenční časy a zároveň optimalizovalo tvar píku. Kalibrační křivky (0.0025–12.5 µM) vykázaly koeficienty determinace 0.990–0.999 a LLOQ 0.0063–1.25 µM. Aplikační testy v potkaních vzorcích prokázaly vysokou citlivost a reprodukovatelnost, detekci klíčových metabolitů v plazmě, játrech i mozku.

Přínosy a praktické využití metody

• Ostré a symetrické chromatografické píky pro 27 polarizovaných metabolitů
• Vysoká citlivost a nízké hraniční koncentrace detekce
• Spolehlivé rozlišení isobarů
• Robustnost vůči kovovým povrchovým interakcím díky MaxPeak HPS technologii

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda je perspektivní pro rozšíření v oblasti cíleného metabolomického profilu, včetně sekundární metabolismu a aplikace na různé biologické matice. Další vývoj může zahrnovat integraci s jinými chromatografickými režimy, vysokorychlostní kinetiku XIC analýzy a automatizaci přípravy vzorků.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda na systému ACQUITY Premier s Atlantis Premier BEH Z-HILIC kolonou představuje vysoce citlivý a reprodukovatelný postup pro analýzu centrálních metabolit. Stabilita kolony při pH 9.0 a redukce interakcí s kovovými povrchy přispívají k vynikajícímu chromatografickému výkonu, což podpoří aplikace v metabolomice a biochemickém výzkumu.

Reference

1. Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA. Harper's Illustrated Biochemistry. 28th ed. McGraw-Hill; 2009.
2. Ge T, Yang J, Zhou S, Wang Y, Li Y, Tong X. The Role of the Pentose Phosphate Pathway in Diabetes and Cancer. Frontiers in Endocrinology. 2020;11:365.
3. Walter TH et al. Introducing Atlantis BEH Z-HILIC: A Zwitterionic Stationary Phase Based on Hybrid Organic/Inorganic Particles. Waters Application Note 720007311EN; 2021.
4. Lauber M et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper 720006930EN; 2020.
5. Want EJ et al. Global Metabolomic Profiling of Animal and Human Tissues via UPLC-MS. Anal Biochem. 2013;8:17–32.
6. Bajad SU et al. Separation and Quantitation of Water Soluble Cellular Metabolites by HILIC–MS/MS. J Chromatogr A. 2010;1125:76–88.
7. Teleki A, Sánchez-Kopper A, Takors R. Alkaline Conditions in HILIC for Metabolite Quantification. Anal Biochem. 2015;475:4–13.
8. Zhang T et al. Evaluation of HILIC with Orbitrap MS for Metabolomic Studies of Human Urine. Anal Chem. 2012;84:1994–2001.
9. Zhang R et al. Evaluation of Mobile Phase Characteristics on Zwitterionic Columns for Untargeted Metabolite Profiling. J Chromatogr A. 2014;1362:168–179.
10. DeLano M et al. Using MaxPeak HPS to Mitigate Analyte Interactions With Metal Surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93(14):5773–5781.
11. Walter TH et al. Low Adsorption UPLC Systems and Columns Based on MaxPeak HPS: The ACQUITY Premier Solution. Waters White Paper 720007128EN; 2021.