Sampling the human population – ultra-high- throughput plasma protein profiling (uHTPPP) sample preparation for translational proteomics

Význam tématu

Large-scale plasma proteomika vyžaduje spolehlivou, reprodukovatelnou a rychlou přípravu vzorků. Manuální postupy jsou časově náročné a mohou přidávat chybovost, což omezuje proveditelnost studií zahrnujících stovky až tisíce vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je představit ultra vysokokapacitní workflow uHTPPP pro přípravu krevní plazmy a séra na platformě Hamilton Microlab STARLet s minimem manuálních zásahů a vysokou přesností, optimalizované pro translational proteomics velkých lidských populací.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow je založen na komerčním Thermo Scientific EasyPep 96 MS Sample Prep Kit a Hamilton Microlab STARLet s modulárními jednotkami [MPE]2 pro pozitivní tlak a odpařování.
Pro digesci se používá směs trypsin LysC a pro kvantifikaci peptidů Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay.
Analytická separace probíhá na systému Evosep One s 21minutovou gradientní metodou (60 vzorků/den) a detekce na hybridním kvadrupól-Orbitrap Q Exactive HF-X.
Software Proteome Discoverer 2.4 slouží pro vyhledávání MS2 spekter v proteomové databázi s 1% FDR.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pipetovacích tříd zajistila přesnost <3% CV pro in-solution roztoky a <1% CV pro čistící pufry.
Pro ověření přesnosti 5µl pipetáže fluoresceinu byla vyvinuta QC skripta s CV <5% u 48 i 96 dělení.
Automatizovaná metoda dosahuje lepší výtěžnosti peptidů než manuální spin kolóny (80,7 vs 77,9 % pro celý workflow) a zkracuje dobu přípravy z 20 na 2,5 min na vzorek.
Reprodukovatelnost v rámci jedné destičky dosahovala 7,2% CV, mezi destičkami 8,6% CV u poolované séra a 20,4% CV u individuálních pacientských vzorků.
LC-MS/MS analýza ukázala stabilní identifikace 188 proteinových skupin s nízkými variacemi (<3,1% CV u významných parametrů).

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje zpracovat až 96 vzorků za 4 hodiny s minimem manuálních zásahů a důkladnou QA/QC kontrolou.
Výsledný protokol je ideální pro velké kohortní studie, klinickou proteomiku a průmyslovou analytiku se zvýšenou reproducibilitou a efektivitou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Workflow lze rozšířit o zásady multiplexního značení (TMT), frakcionaci peptidů i kombinovat s různými LC-MS platformami.
Automatizovaná QC skripta lze adaptovat pro další nutriční a biomarkerové studie.
Potenciální je i integrace na multi-omics pipeliny a klinické diagnostiky.

Závěr

Prokázali jsme, že uHTPPP představuje robustní, rychlou a vysoce reprodukovatelnou automatizovanou přípravu vzorků plazmy a séra pro hmotnostní spektrometrii ve velkých populacích, s vylepšenou výtěžností peptidů a sníženou variabilitou.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific EasyPep 96 MS Sample Prep Kit, EasyPep Mini MS Kit
• Hamilton Microlab STARLet s moduly [MPE]2
• Evosep One LC systém a EvoTip trapy
• Thermo Scientific Q Exactive HF-X Orbitrap MS
• Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay, Invitrogen Fluorescein NIST-Traceable Standard
• Proteome Discoverer 2.4 software, UniProt databáze