Improvements to ProSightPD nodes in the Thermo Scientific Proteome Discoverer Software Framework

Význam tématu

Analýza proteoform pomocí top-down proteomiky umožňuje identifikaci intactních proteinů včetně posttranslačních modifikací a sekvenčních variant.

Integrace ProSightPD do softwarového prostředí Proteome Discoverer přináší přehledný vícestupňový workflow pro detailní charakterizaci proteomů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat aplikaci ProSightPD uzlů pro analýzu komplexních top-down dat získaných z WHIM2 a WHIM16 xenograft vzorků proteomu.

Autoři porovnali výkon pětistupňového vyhledávání pro High/High frakce a třístupňového pro Low/High frakce spolu s integrací výsledků sliding window dekonvoluce.

Použitá metodika a instrumentace

Výchozí data pochází ze studie Ntai et al. (CPTAC) a zahrnují GELFrEE frakcionaci High/High a Low/High vzorků.

Analýzu řídí Proteome Discoverer s ProSightPD uzly:

• cRAWler s Xtract dekonvolucí MS a MS/MS spekter
• ReSpect dekonvoluce pro Low/High data
• Pětistupňové vyhledávání: myš, lidský proteom, varianty, truncace, error-tolerantní search
• Tolerance: 2,2 Da pro MS1 (ion trap), 10 ppm pro MS/MS
• Integrace dat pomocí Perl skriptu, normalizace a p-value v InfernoRDN a Excel

Hlavní výsledky a diskuse

High/High běhy identifikovaly 2 374 proteoform s 735 proteoformy C-score ≥ 3. Low/High vyhledávání odhalilo 254 proteoform, z nichž 38 mělo C-score ≥ 3.

Integrace sliding window dekonvoluce odhalila více než 400 proteoform s významnými rozdíly mezi WHIM2 a WHIM16.

WHIM2 vzorky měly vyšší počet PrSM (spektrálních přiřazení) než WHIM16, což odpovídá většímu množství výchozího materiálu.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost detailní kvantifikace proteoform bez značení (label-free)
• Vícestupňový workflow zvyšuje citlivost a selektivitu identifikace
• C-score jako klíčová metrika kvality charakterizace proteoform
• Integrace dekonvoluce pro statistické vyhodnocení a p-value

Budoucí trendy a možnosti využití

• Využití vyššího rozlišení MS1 (např. 15 000) pro zúžení tolerance předkurzorové hmotnosti
• Nasazení různých MS/MS režimů (CID, ETD) pro lepší pokrytí vnitřních oblastí proteinů
• Rozšíření databází o nové posttranslační modifikace a sekvenční varianty
• Integrace strojového učení pro automatizaci interpretace výsledků

Závěr

ProSightPD uzly v rámci Proteome Discoverer přinášejí robustní a flexibilní platformu pro analýzu složitých top-down proteomických dat. C-score a sliding window dekonvoluce výrazně zvyšují kvalitu pověření a kvantifikace proteoform.

Reference

• Ntai I. et al., Mol. Cell. Proteomics 2016, 15, 45–56
• LeDuc R. D. et al., J. Proteome Res. 2014, 13, 3231–3240
• Fellers R. T. et al., Proteomics 2015, 15, 1235–1238