Quantitative Top-Down Proteomics of Human Tears Reveals Proteoform Changes Related to Age

Význam tématu

Analýza proteoform v lidských slzách představuje inovativní přístup ke studiu molekulárních změn souvisejících se stářím. Slzy jsou snadno dostupným tělním materiálem bohatým na proteiny, které odrážejí nejen stav oka, ale i systémové procesy v organismu. Top-down proteomika umožňuje přímé měření intactních proteoform, čímž odhaluje biologické informace ztracené při konvenčním peptidovém přístupu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo aplikovat nový workflow Top-down Label Free Quantitation (LFQ) pro kvantitativní sledování změn proteoform v očních slzách dvou věkových skupin (mladí vs. staří). Studie porovnala různé fragmentační metody a vyhodnotila schopnost odhalit proteoformy včetně trunovaných a disulfidických forem.

Použitá metodika a instrumentace

Odběr:

• Neinvazivní Schirmerovy testovací proužky pro zachycení slzného filmu.
• Extrakce bílkovin vodným pufrem, zmražení a následné rozmražení a odstředění.

Instrumentace:

• Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Tribrid™ upravený modul UVPD (213 nm) pro MS/MS fragmentaci.
• LC separace před hmotnostní analýzou.

Bioinformatika:

• ProSightPD 4.0 (beta) v prostředí Proteome Discoverer pro dekonvoluci (Sliding Window Deconvolution), identifikaci a kvantifikaci proteoform.
• Subsequence analýza k odhalení dosud neznámých trunovaných forem.

Hlavní výsledky a diskuse

• UVPD poskytuje nadřazenou fragmentaci disulfidicky crosslinkovaných regionů (např. lysozym), kde HCD a ETD selhávají bez předchozí alkylace.
• Identifikováno bylo množství proteoform mimo záznamy UniProt, zejména trunovaných variant.
• Proteoformy Proline Rich Protein 4 (PRP4) vykazují věkově diferencovaný vzorec: některé trunované formy dominují v mladé skupině, jiné jsou zvýšené u starších donorů.
• Clustering string analýza odhalila asociace PRP4 s regulačními proteiny CST4, LACRT a enzymy ovlivňujícími CNS a sulfátovou modifikaci.
• Přímá proteoformová kvantifikace odhaluje dynamiku proteolýzy, skrytou při klasickém peptidovém LFQ.

Přínosy a praktické využití metody

Top-down LFQ s UVPD:

• Umožňuje přesné sledování intactních proteoform bez inferenčních kroků.
• Odhaluje nové biomarkery založené na trunovaných a modifikovaných variantách.
• Vhodné pro řízení kvality a výzkum očních a systémových onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další tělní tekutiny (plasma, mozkomíšní mok) a studie nemocí spojených se stářím.
• Integrace dalších pokročilých fragmentačních metod a multimodálních přístrojů pro hlubší pokrytí proteomu.
• Vylepšení automatizace a bioinformatických nástrojů pro rychlejší dekonvoluci a identifikaci komplexních proteoform.

Závěr

Nový top-down LFQ přístup s UVPD fragmentací na Orbitrap Fusion Tribrid MS společně s ProSightPD 4.0 umožňuje detailní kvantifikaci proteoform v lidských slzách. Metoda odhalila věkové změny proteoform, které by tradiční peptidová analýza přehlédla, a otevírá cestu k identifikaci nových biomarkerů a pochopení proteolytických procesů v praxi.

Reference

1. Von Thun und Hohenstein-Blaul N, Funke S, Grus FH. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 2013;117:126–137.
2. Moehring F, Waas M, Keppel TR, Rathore D, Cowie A, Stucky C, Gundry RL. Quantitative Top-Down Mass Spectrometry Identifies Proteoforms Differentially Released during Mechanical Stimulation of Mouse Skin. J Proteome Res. 2018;8:2635–2648.