High-throughput Top-down FAIMS Data Analysis with ProSightPD Nodes in Proteome Discoverer Software

Význam tématu

Top-down proteomika je cenná pro identifikaci a charakterizaci intact proteoforms, ale je omezena obtížnou chromatografickou separací a širokým dynamickým rozsahem proteinů. High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry (FAIMS) představuje technologii, která separuje ionty podle jejich mobilit v plynné fázi, což zlepšuje detekci nízce zastoupených proteoforms.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo zhodnotit výkon ProSightPD uzlů v Proteome Discoverer pro analýzu top-down FAIMS dat a porovnat výsledky s konvenční LC–MS metodikou bez FAIMS.

Použitá metodika a instrumentace

• Odběr a frakcionace: primární lidské CD3+ T buňky a neutrofily; separace pomocí GELFrEE a PLRP-S.
• Chromatografie: RP4H monolitické kolony na EASY-nLC 1200.
• Ionizace a separace: Thermo Scientific EASY-Spray LC a FAIMS Pro rozhraní s CV střídáním.
• Analytika: Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS s vysokým rozlišením MS1 i MS2.
• Software: Proteome Discoverer 2.3 s ProSightPD 2.0–3.0, cRAWler uzly, Hi Hi workflow, databáze Homo sapiens (2019).

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce monoisotopických signálů (S/N>3) se zvýšila o 113 % při použití více CV.
• Identifikace proteoforms vzrostla o 17 % a proteinových accesí o 43 %.
• Oproti konvenční metodě bylo o 35 % více charakterizovaných proteoforms (C-Score>40).
• FAIMS rozděluje PrSM záznamy mezi více proteoforms a odhaluje nízce zastoupené druhy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená hloubka pokrytí proteomu bez dodatečné složité předúpravy vzorku.
• Selektivní přenos iontů různé abundace pomocí řízených CV.
• Integrovaná analýza FAIMS v ProSightPD v rámci Proteome Discoverer zjednodušuje a automatizuje workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace napětí FAIMS, časů přepínání CV a kombinace s dalšími separačními technikami (např. kapilární elektroforéza) mohou dále zlepšit pokrytí proteomu. Rozvoj vizualizačních nástrojů a automatizovaných pipeline podpoří vysokopropustnou top-down proteomiku.

Závěr

Integrace FAIMS Pro rozhraní s ProSightPD přináší významné zlepšení detekce a charakterizace intact proteoforms v top-down přístupu a nabízí robustní platformu pro hloubkovou analýzu komplexních biologických vzorků.

Reference

• Lee JE, Kellie JF, Tran JC et al. A robust two-dimensional separation for top-down tandem mass spectrometry of the low-mass proteome. J Am Soc Mass Spectrom. 2009;20(12):2183–2191.
• Hebert AS, Prasad S, Belford MW et al. Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem. 2018;90(15):9529–9537.