High quality curated HRAM MSn spectral libraries and real time library search for the confident annotation of metabolites

Význam tématu

Ve vysoce konkurenčním prostředí metabolomiky je spolehlivá identifikace látek klíčová pro interpretaci biochemických procesů. Využití vysoce kvalitních HRAM MSn spektrálních knih spolu s inteligentním řízením akvizice (RTLS) umožňuje cílené zachycení a důvěryhodnou anotaci biologicky významných sloučenin, jako jsou flavonoidy v komplexních vzorcích (např. čajové extrakty).

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit a ověřit workflow kombinující:

• stavbu třídy specifické spektrální knihy flavonoidů z autentických standardů (HRAM MSn),
• aplikaci Real Time Library Search (RTLS) pro řízení MSn akvizice přímo na přístroji,
• konfidentní anotaci neznámých flavonoidů v extraktech zeleného a černého čaje.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestávalo z následujících kroků:

• Příprava vzorků: extrakce tří druhů zeleného, černého a bylinného čaje horkou vodou; příprava poolu pro QC.
• Separace: Vanquish Horizon UHPLC se sloupcem Accucore C18+ (2.1×150 mm, 1.5 μm), 55 °C, gradient FA ve vodě/methanolu.
• Spektrální knihovna: sběr MSn dat (MS2–MS5) z 40 autentických flavonoidových standardů pomocí Orbitrap IQ-X Tribrid MS, zpracování v Mass Frontier 8.0 a Compound Discoverer 3.3, export do mzVault 2.3.
• RTLS akvizice: šablona Met-IQ na Orbitrap IQ-X pro real-time vyhledávání spekter v lokální mzVault knihovně a automatické spouštění MS3 u podobných látek.
• Zpracování dat: Compound Discoverer 3.3 pro chromatografickou dekonvoluci, mapování a statistickou analýzu; využití Arita Flavonoid Database (~6500 struktur) pro podporu anotací.

Hlavní výsledky a diskuse

Nasazením RTLS bylo ze vzorků čajů identifikováno o téměř 100 více putativních flavonoidů než při klasické datové akvizici bez RTLS. Filtrace výsledků v Compound Discoverer ukázala výrazné navýšení zájmových struktur přímo spouštěných k MSn analýze. Rozdíly mezi zeleným a černým čajem byly vizualizovány pomocí vulkánového grafu, který zdůraznil specifické fold-change změny rel. abundancí flavonoidů.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledné workflow nabízí:

• rychlejší a efektivnější hluboké prolétnutí vzorku s cílenou akvizicí flavonoidů,
• vyšší důvěryhodnost anotací díky HRAM MSn spektrálním knihovnám,
• snadnou integraci do rutinních analytických režimů v biochemických a potravinářských laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že RTLS a podobné inteligentní akviziční strategie budou rozšiřovány:

• na další třídy metabolitů (alkaloidy, lipidy, peptidy),
• v rámci multi-omics studií pro korelační analýzu a linkování dat,
• v reálném čase pro klinickou diagnostiku nebo online monitorování procesů.

Závěr

Implementace HRAM MSn spektrálních knihoven společně s Real Time Library Search významně zvyšuje hloubku a spolehlivost metabolomické analýzy. U flavonoidů v čajových extraktech se potvrdilo navýšení počtu detekovaných struktur a jejich kvalitativní anotace, což předurčuje tuto metodu pro široké využití v akademických i průmyslových aplikacích.

Reference

• Deshpande R., Amer B., Hermanson D., Bills B., Tague E., Bird S., Jafari R., Rafeie P. & Hühmer A. High quality curated HRAM MSn spectral libraries and real time library search for the confident annotation of metabolites. Thermo Fisher Scientific, 2021.