Characterization of mRNA vaccine 5’ and 3’ end products using BioPharma Finder 5.0

Význam tématu

Produkce mRNA vakcín a terapeutik vyžaduje spolehlivé metody kontroly kvality na úrovni jednotlivých molekulárních modifikací. Přesná charakterizace 5’ kapu a 3’ poly(A) ocasu je klíčová pro stabilitu, translaci a odolnost vůči degradaci. Inovativní softwarová řešení pro automatizovanou analýzu dat z LC-MS/MS výrazně zkracují dobu zpracování a zlepšují reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo zavést workflow založené na softwaru Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0 pro automatizovanou detekci a kvantifikaci produktů enzymatických šarží 5’ a 3’ konců in vitro syntetizované mRNA. Studie demonstruje postup pro enzymatickou úpravu, chromatografickou separaci, HRAM LC-MS/MS analýzu a následné zpracování dat. Výsledky poskytují detailní přehled metodiky, parametrů zpracování a úrovně přesnosti kvantifikace.

Použitá metodika

• 5’ capping: Hybridizace biotinylovaného DNA/RNA sondu k 5’ konci mRNA, štěpení RNase H, izolace pomocí streptavidinových magnetických kuliček a eluční krok ethanolem.
• 3’ poly(A) charakterizace: Jednohodinová štěpná reakce RNase T1, zachycení poly(A) fragmentů Oligo(dT)25 kuličkami, vysušení ve speedvac a rehydratace před UHPLC injekcí.
• Chromatografie: Reverzní fázová UHPLC na DNAPac RP kolóně s modifikátory HFIP/TEA nebo HFIP/DBA.
• MS/MS: High-resolution akvizice na Orbitrap Exploris 240 v módu dceřinných skenů (ddMS2) pro mapování fragmentů a v módu Intact Protein pro dekonvoluci poly(A).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC systém
• DNAPac RP kolona
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240
• Magnetické kuličky streptavidin a Dynabeads Oligo(dT)25
• Speedvac pro sušení vzorků
• Biochemické činidla: RNase H, RNase T1, HFIP, TEA, DBA, acetonitril

Hlavní výsledky a diskuse

• Automatizovaná sekvenční analýza softwaru identifikovala 5’ kap a jeho varianty dle monoisotopových hmotností a fragmentačního profilu.
• Relativní kvantifikace poměru cap/uncapped produktů na základě extrahovaných iontových chromatogramů ukázala 24 % kapovaných molekul, s odchylkou do 4 % oproti teoretické hodnotě.
• Intaktní analýza poly(A) ocasu umožnila dekonvoluci monoisotopového spektra, identifikaci truncací a stanovení distribuce délek mezi 121–126 adenosiny, v souladu s očekávanou délkou.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení času zpracování dat díky automatizované anotaci a kvantifikaci.
• Zvýšení reprodukovatelnosti výsledků pro vývoj a validaci mRNA terapeutik.
• Možnost rychlého nasazení pro kontrolu kvality ve výrobních procesech mRNA vakcín.

Budoucí trendy a možnosti využití

Použití umělé inteligence a strojového učení pro predikci fragmentace a detekci neznámých modifikací. Rozšíření workflow o multiplexní analýzu různých typů RNA. Integrace s online QC systémy pro kontinuální monitoring kvality během výroby.

Závěr

Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0 nabízí robustní a efektivní platformu pro detailní charakterizaci 5’ a 3’ konců mRNA. Automatizované zpracování a vizualizace dat podporuje rychlé rozhodování a zajišťuje vysokou přesnost kvantifikace, čímž splňuje náročné požadavky na kontrolu kvality mRNA terapeutik.

Reference

• Ross RL, Qi Q, Murphy K, Du M. Characterization of mRNA vaccine 5’ and 3’ end products using BioPharma Finder 5.0. Thermo Fisher Scientific; 2022.