Advances in Orbitrap Instrumentation for Native Top-Down Analysis of Non-Covalent Protein Complexes

Význam tématu

Native MS top-down analýza umožňuje studium masivních nativních proteinových komplexů v jejich funkčním stavu. Tato metoda zachovává nekovalentní interakce a umožňuje přímé mapování podjednotek, což je klíčové pro strukturální biologii, farmakologii a průmyslovou analýzu proteinových assemblů.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotila výkon platformy Thermo Scientific Q Exactive UHMR pro nativní MS a top-down analýzu heteromerických komplexů. Autoři demonstrovali, jak hardwarové a softwarové úpravy zlepšují přenos a fragmentaci vysokom/z iontů na modelových systémech GroEL, 20S proteasomu, LmrP a AmtB.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala pseudo-MS3 přístup s těmito vylepšeními:

• In-source trapping v injekčním flatapole pro efektivní odstraňování solvatace a detergentů
• Snížení frekvencí RF napětí na tokových multipolech, kvadrupólu a HCD buňce
• Optimalizace rampy napětí Orbitrap analyzátoru pro lepší zachycení vysokom/z iontů
• Kontrola tlaku plynů a zvýšení maximální HCD energie na 300 V

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap
• In-source trapping, Advanced Active Beam Guide (AABG) a Advanced Quadrupole Technology (AQT)
• HCD buňka pro pseudo-MS3 experimenty
• Softwarový modul ReSpect pro vysoce přesnou dekonvoluci

Hlavní výsledky a diskuse

Fragmentace GroEL 14-mer vedla k identifikaci monomerů a striptnutých komplexů s 21 % sekvenčním pokrytím. 20S proteasom z králíka vykázal hmotnost 717 023 Da (odchylka < 0,082 %) a pseudo-MS3 umožnilo rozeznat šest z 7 alfa-subjednotek, včetně jejich fosforylovaných forem. Membránové proteiny LmrP a AmtB byly uvolněny z detergentových micel, přičemž AmtB trimer dosáhl 19 % pokrytí b a y ionty.

Přínosy a praktické využití metody

• Strukturální charakterizace komplexních proteinových assemblů v nativním stavu
• Studium ligand–protein interakcí a posttranslačních modifikací
• QA/QC analýza biologických léčiv a průmyslová kontrola kvality
• Zrychlená analýza obtížně čistitelných membránových proteinů

Budoucí trendy a možnosti využití

Důležitým směrem je integrace s iontovou mobilitou pro oddělení izobarických forem a zvýšení selektivity. Větší rozlišení a rychlejší akvizice podpoří dynamické studie konformačních změn. Kombinace s výpočetně orientovanými nástroji a strojovým učením zajistí automatizovanou interpretaci komplexních spekter.

Závěr

Upravený Q Exactive UHMR prokázal vynikající schopnost zachovat a analyzovat velké nekovalentní proteinové komplexy v nativním stavu. Hardwarové úpravy a softwarové nástroje otevírají nové možnosti v nativní top-down proteomice a strukturální biologii.

Reference

Analytické práce citované ve studii:

• Belov ME, Damoc E, Denisov E, Compton PD, Horning S, Makarov AA, Kelleher NL. Anal Chem. 2013;85(23):11163–73.
• Ben-Nissan G, Belov ME, Morgenstern D, Levin Y, Dym O, Arkind G, Lipson C, Makarov AA, Sharon M. Anal Chem. 2017;89(8):4708–15.
• van de Waterbeemd M, Fort KL, Boll D, Reinhardt-Szyba M, Routh A, Makarov A, Heck AJ. Nat Methods. 2017;14(3):283–6.
• Fort KL, van de Waterbeemd M, Boll D, Reinhardt-Szyba M, Belov ME, Sasaki E, Zschoche R, Hilvert D, Makarov AA, Heck AJR. Analyst. 2017;143(1):100–105.