LipidQuan™: A Robust LC-MS/MS Methodology for Rapidly Profiling the Lipidome of Liver Tissue Following Metabolism of the Drug Gefitinib

Význam tématu

Lipidomika se stala klíčovou metodou pro pochopení rolí lipidů v biologii, onemocněních a odpovědích na farmakologické zásahy. Rychlá a spolehlivá analýza stovek lipidů umožňuje sledovat dynamiku metabolických drah v reálném čase a odhalit účinky léčiv na buněčnou homeostázu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje aplikaci metody LipidQuan™ pro profilování lipidomu myší jater po intravenózní aplikaci inhibitoru EGFR tyrosinkinázy gefitinibu. Cílem bylo sledovat časový průběh změn v koncentracích více než 500 biologicky relevantních lipidů a vyhodnotit dysregulaci lipidové metabolizace indukovanou podáním léku.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup využívá HILIC separaci kombinovanou s tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) v pozitivním i negativním ionizačním módu. Extrakce lipidů z tkáně proběhla metodou dichlormethan/methanol podle Want et al., včetně stabilních izotopových interních standardů SPLASH LIPIDOMIX a ceramid LIPIDOMIX. Po odpaření se vzorky rekonstituovaly v IPA/ACN a analyzovaly se v náhodném pořadí.

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class FTN
• MS detektor: Xevo TQ-XS Tandemový kvadrupól
• Kolona: UPLC BEH Amide 2.1×100 mm, 1.7 μm při 45 °C
• Pohyblivé fáze: A) 95 % ACN/5 % 10 mM acetát amonný, B) 50 % ACN/50 % voda/10 mM acetát amonný
• Gradient: 1→20 % B za 2 min, 20→80 % B za 3 min, re-equilibrace 3 min
• MS podmínky: MRM akvizice, zdrojová teplota 120 °C, desolvace 500 °C, kapilární napětí +2,8/–1,9 kV
• Software: TargetLynx™ XS, Skyline, MetaboAnalyst, Spotfire

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila kvantifikovat 238 lipidů v pozitivním a 232 lipidů v negativním módu s liniovou odezvou přes tři řády velikosti. Multivariační analýza (PCA, PLS-DA) oddělila skupinu po podání gefitinibu od kontrol, ukazující výraznou dysregulaci lipidového profilu. Časová trajektorie v PLS-DA modelu prokázala postupný nárůst signálů volných mastných kyselin, fosfoethanolaminů, fosfoglycerolů a lysolipidů až do 8. hodiny, s částečným návratem k výchozím hodnotám po 24 hodinách.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda LipidQuan nabízí:

• Rychlou analýzu lipidomu do 8 minut
• Vysoce specifičtí MRM přechody se dvěma fragmenty kyselin pro fosfolipidy
• Robustní kvantifikaci stovek lipidů v jednom experimentu
• Snadnou implementaci a nízké náklady na vývoj

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření metody může zahrnovat integraci iontové mobility pro lepší separaci izobarických lipidů, automatizaci přípravy vzorků a využití pokročilých statistických nástrojů či strojového učení pro predikci farmakologických a toxikologických účinků. Real-time lipidomika ve spojení s jinými ‘omics’ přístupy nabídne komplexnější obraz biologických procesů.

Závěr

LipidQuan™ se ukázal jako výkonný a robustní nástroj pro kvantitativní lipidomiku jaterních tkání za podání gefitinibu. Metoda umožňuje rychlé, přesné a reprodukovatelné sledování časově závislých změn lipidového profilu, což je klíčové pro farmakokinetické i toxikologické studie.

Reference

1. Han X. Lipidomics for Studying Metabolism. Nat. Rev. Endocrinol. 2016, 12, 668–679.
2. Eghlimi R. et al. Triple Negative Breast Cancer Detection Using LC-MS/MS Lipidomic Profiling. J. Proteome Res. 2020, 19, 2367–2378.
3. McKillop D. et al. Metabolic Disposition of Gefitinib in Rat, Dog and Man. Xenobiotica 2005, 34, 914–934.
4. Molloy B.J. et al. Rapid Determination of Pharmacokinetics and Metabolic Fate of Gefitinib in Mouse. Xenobiotica 2021, 51, 434–446.
5. Want E. et al. Global Metabolic Profiling of Animal and Human Tissues via UPLC-MS. Nat Protoc. 2013, 8, 17–32.
6. Chong J. et al. MetaboAnalyst 4.0: Towards Transparent and Integrative Metabolomics Analysis. Nucleic Acids Res. 2018, 46, W486–494.