LipidQuan: Quantifying the Lipidome of Transgenic Mice Tissue Extracts, a Rapid and Comprehensive Targeted Approach

Význam tématu

Analýza lipidomu hraje klíčovou roli v biochemii i medicínském výzkumu, protože lipidové profily odrážejí metabolické a patologické stavy organismu. Rychlá a cílená kvantifikace stovek lipidů umožňuje detailní zkoumání biochemických změn, sledování účinků genových modifikací a vývoj nových diagnostických markerů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na optimalizaci a validaci workflow LipidQuan pro cílenou kvantifikaci lipidů z extraktů hnědé tukové tkáně divokého typu a LRG1-knockout myší. Cílem bylo vyvinout rychlou, robustní a snadno nasaditelnou metodu na platformě Waters pro kvantifikaci přibližně 500 lipidů s minimální metodologickou variabilitou.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky adipózní tkáně (~30 mg) byly extrahovány klasickou metodou Bligh–Dyer (chloroform : methanol 2 : 1) a rehydratovány v isopropanolu. Pro kvantifikaci byly do vzorků přidány stabilně značené izotopové standardy (SPLASH® LIPIDOMIX® a deuterované Ceramidy). Analýza probíhala v režimech pozitivní i negativní ESI pomocí přístrojů a softwaru Waters:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS / H-Class PLUS
• ACQUITY UPLC BEH Amide kolona (2.1×100 mm, 1.7 μm)
• Xevo TQ-XS, Xevo TQ-S, Xevo TQ-S micro
• Ionizační režim ESI (+/-), režim akvizice MRM
• TargetLynx™ Application Manager, MassLynx™, Quanpedia™

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila detekci a kvantifikaci více než 400 lipidů. Použití HILIC chromatografie a MRM přechodů specifických pro mastné kyseliny zlepšilo rozlišení izobarických a izomerických lipidů. Multivariační analýza (PCA, PLS-DA) jasně oddělila vzorky divokého typu od LRG1-knockout skupiny s hodnotou Q2 ~90 %, což svědčí o prediktivní síle modelu. Nejvýznamnější rozdíly byly nalezeny v třídách fosfatidylcholinů, lysofosfatidylcholinů a sphingomyelinů. LRG1-/- myši vykazovaly zvýšené plasmalogeny a změny v profilu fosfolipidů, což indikuje remodelaci membrán a energetického metabolismu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: osmiminutová analýza jednoho vzorku včetně re-equilibrační fáze
• Robustnost: plně cílená MRM metoda stažená z TOML přes Quanpedia minimalizuje chyby při nastavování
• Ekonomičnost: použití premixu izotopových standardů snižuje náklady na rozsáhlé studie
• Široká využitelnost: metoda je vhodná pro farmakologický výzkum, translační medicínu i QA/QC v potravinářské a kosmetické analýze

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření cílených lipidomických metod o další návrhové lipidové třídy a integrace s metabolomikou či proteomikou pro komplexní systémy „multi-omics“. Vývoj softwarových nástrojů a databází MRM přechodů přispěje k automatizaci zpracování dat a vyšší průchodnosti laboratoří. Dále lze metodu adaptovat pro klinické vzorky (plasma, biopsie) s cílem identifikovat nové biomarkery chronických onemocnění.

Závěr

Popsané LipidQuan workflow ukazuje, že je možné dosáhnout rychlé, citlivé a spolehlivé kvantifikace stovek lipidů v malých objemech biologických vzorků. Metoda prokázala schopnost odlišit metabolické profily divokého typu a LRG1-knockout myší a nabízí efektivní nástroj pro hluboký lipidomický výzkum.

Reference

1. Wang X. et al. LRG1 Promotes Angiogenesis by Modulating Endothelial TGF-beta Signalling. Nature. 2013, 499(7458):306–11.
2. Zhang J. et al. Identification of CTLA2A, DEFB29, WFDC15B, SERPINA1F and MUP19 as Novel Tissue-Specific Secretory Factors in Mouse. PLoS One. 2015, 10(5):e0124962.
3. Isaac G., Munjoma N., Gethings L., Plumb R. LipidQuan for Comprehensive and High-Throughput HILIC-based LC-MS/MS Targeted Lipid Quantitation. Waters Application Note 720006402EN, 2019.
4. Bligh E.G., Dyer W.J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37:911–917.
5. Chong J., Wishart D.S., Xia J. Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Curr. Protoc. Bioinformatics. 2019, 68:e86.
6. Koivusalo M. et al. Quantitative Determination of Phospholipid Compositions by ESI-MS: Effects of Acyl Chain Length, Unsaturation, and Lipid Concentration on Instrument Response. J. Lipid Res. 2001, 42(4):663–672.