TIDES: INTACT MASS - A VERSATILE SOFTWARE FOR RAPID MASS CONFIRMATION OF OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR IMPURITIES

Význam tématu

Vývoj oligonukleotidových léčiv vyžaduje spolehlivou analýzu jejich celkové hmotnosti a čistoty. IP-RP LC-MS v negativním režimu ESI patří mezi klíčové metody pro detekci a kvantifikaci nečistot v syntetických siRNA a sgRNA.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo představit automatizovaný, compliance-ready LC-MS workflow implementovaný ve waters_connect INTACT Mass aplikaci na BioAccord a ACQUITY Premier UPLC. Studie demonstrovala rychlé potvrzení intaktní hmotnosti a profil nečistot 21-mer siRNA a 100-mer sgRNA s cílovou hmotnostní přesností <10 ppm respektive <20 ppm.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci 21-mer siRNA byla použita ACQUITY Premier UPLC kolona OST (2.1×100 mm, 1.7 µm) s mobilní fází IP-RP: 7 mM TEA / 40 mM HFIP (pH 8,6) a 3,5 mM TEA / 20 mM HFIP v 50 % methanolu. Pro 100-mer sgRNA se využily gradienty s 8 mM DIPEA / 40 mM HFIP a 4 mM DIPEA / 4 mM HFIP v 75 % acetonitrilu. Průtok byl 0,3 mL/min při 60 °C. Analytický systém tvořil BioAccord LC-MS s ESI v negativním módu a INTACT Mass software s BayesSpray dekonvolučním algoritmem.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow zajistil hmotnostní přesnost pod 10 ppm pro siRNA a pod 20 ppm pro sgRNA. Byly identifikovány nečistoty až do úrovně 0,2 % u siRNA a cca 1 % u sgRNA. CSH kolona prokázala lepší rozlišení některých modifikovaných produktů. Automatizovaná dekonvoluce pokrývala celý chromatografický profil a urychlila zpracování dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší propustnost a standardizace procesů QC.
• Citlivá detekce a kvantifikace nečistot.
• Podpora dodržování regulačních požadavků díky ověřené hmotnostní přesnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na delší a komplexně modifikované oligonukleotidy, integrace s LIMS a využití pokročilých algoritmů strojového učení pro zpracování MS dat. Vývoj nových stacionárních fází i multiplikačních technik zvýší citlivost a selektivitu analýz.

Závěr

INTACT Mass workflow na BioAccord a ACQUITY Premier nabízí rychlé a přesné potvrzení hmotnosti a profil nečistot siRNA a sgRNA. Metoda zvyšuje efektivitu QC procesů a splňuje přísné požadavky na hmotnostní přesnost a citlivost.

Reference

1. Sharma VK, Watts JK. Oligonucleotide therapeutics: chemistry, delivery and clinical progress. Future Med Chem. 2015;7(16):2221-2242.
2. An Automated Compliance-Ready LC-MS Workflow for Intact Mass Confirmation and Purity Analysis of Oligonucleotides. Waters application note P/N 720006820EN, 2020.
3. Intact Mass Confirmation Analysis on the BioAccord LC-MS System for a Variety of Extensively Modified Oligonucleotides. Waters application note P/N 720007028EN, 2020.
4. Analysis of Oligonucleotide Impurities on the BioAccord System with ACQUITY Premier. Waters application note P/N 720007301EN, 2021.
5. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System with ACQUITY Premier and New Automated INTACT Mass Application. Waters application note P/N 720007546EN, 2022.