An improved method for galactosyl oligosaccharide characterization

Význam tématu

Galaktosyl-oligosacharidy (GOS) patří mezi významné prebiotika, která stimulují růst prospěšných bakterií ve střevech a přispívají k trávení a imunitnímu zdraví. Detailní charakterizace složení a struktury GOS je klíčová pro porozumění jejich biologické účinnosti a optimalizaci výroby ve farmaceutickém i potravinářském průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikované Application Note bylo vyvinout a demonstrovat vysoce efektivní metodu pro separaci a identifikaci GOS pomocí kombinace HPAE-PAD a vysoko-výkonného Orbitrapového hmotnostního analyzátoru. Studie představuje nový analytický protokol, který zjednodušuje stanovení stupně polymerace (DP) a zvyšuje rozlišení jednotlivých oligosacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

Separační metoda využívá vysokotlakou aniontovou chromatografii s pulzním amperometrickým detektorem (HPAE-PAD) na kolonu Thermo Scientific Dionex CarboPac PA300-4µm (2×250 mm). Pro detekci intactních GOS slouží paralelně PAD a Orbitrapová hmotová spektrometrie (Q Exactive) v negativním ionizačním režimu. Mezi klíčové prvky patří:

• Ion chromatografický systém Dionex ICS-5000+ (nebo ICS-6000) s DP duálním čerpadlem a DC detekčním modulem
• Autosampler Thermo Scientific Dionex AS-AP s ochlazovanou zásobníkovou policí
• Desaltační jednotka Dionex ERD 500 pro výměnu Na+ za H+ před MS
• Dionex CarboPac PA300 2×50 mm guard kolona
• Orbitrapový hmotový spektrometr Q Exactive v negativním režimu
• Software Xcalibur, Chromeleon CDS a Simglycan pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný gradient (0–50 mM NaOH a 0–70 mM NaOAc) umožnil rozlišení 28 GOS frakcí s DP2–DP6. Desalter Dionex ERD 500 reprodukovatelně odstranil >99,5 % sodných iontů bez významné ztráty rozlišení (průměrná změna 14,5 %). Orbitrap provedl přesné měření hmotností s chybou <1,7 ppm a MS2 fragmentace poskytla typické glykozidické a cross-ring fragmenty pro potvrzení DP.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost přímé analýzy GOS bez derivatizace
• Vysoce rozlišená separace i nejhojnějších disacharidů
• Integrované DP stanovení v jednom běhu chromatografie
• Minimalizace frakční kolekce a dodatečné manipulace

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj podobných HPAE-PAD/MS metod lze rozšířit na další komplexní oligosacharidy, např. fukto- nebo mananooligosacharidy. Dalšími kroky jsou automatizace datové analýzy glykoformů, aplikace vyšších rozlišení Orbitrapů a studium strukturálně relačních vazeb v komplexních matricích potravin a biologických vzorcích.

Závěr

Navržená HPAE-PAD/MS metoda s Dionex CarboPac PA300 a ERD 500 desalterem poskytuje robustní, vysoce rozlišenou a citlivou analýzu GOS. Precizní měření hmotností, reprodukovatelné odstranění sodíku a eliminace derivatizačních kroků zefektivňují charakterizaci prebiotik a usnadňují jejich implementaci ve výzkumu a průmyslu.

Reference

1. Macfarlane G., Steed H., Macfarlane S. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. J Appl Microbiol. 2008;104:305–344.
2. Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 1995;125:1401–1412.
3. Ganzle MG. Enzymatic synthesis of galactooligosaccharides and other lactose derivatives (hetero-oligosaccharides) from lactose. Int Dairy J. 2012;22:116–122.
4. Cardelle-Cobas A., Villamiel M., Olano A., Corzo N. Study of galactooligosaccharide formation from lactose using pectinex-Ultra SP-L. J Sci Food Agric. 2008;88:954–961.
5. Hernández-Hernández O., Calvillo I., Lebrón-Aguilar R., Moreno FJ, Sanz ML. Hydrophilic interaction LC–MS for characterization of prebiotic GOS. J Chromatogr A. 2012;1220:57–67.
6. Rohrer JS, Basumallick L, Hurum D. HPAE-PAD for carbohydrate analysis of glycoproteins. Biochemistry (Moscow). 2013;78:697–709.
7. Rohrer JS. High-Performance Anion Exchange Chromatography with PAD for determination of oligosaccharides. ACS Symposium Series 849. 2003;16–31.
8. Thermo Fisher Scientific Application Note AN71993. Profiling GOS by HPAE-PAD. 2020.
9. Coulier L. et al. In-depth characterization of prebiotic GOS by a combination of analytical techniques. J Agric Food Chem. 2009;57(18):8488–8495.
10. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN71. Eluent Preparation for HPAE-PAD. 2020.
11. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN72478. Instrument configuration for HPAE-PAD/MS. 2020.
12. Thermo Fisher Scientific. Dionex ERD 500 Product Manual, Document 031761-05. 2015.