Native Top-Down Analysis of Intact Antibodies using Multiple Dissociation Techniques on a Tribrid Quadrupole Orbitrap Linear Ion Trap Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky se staly klíčovými bioterapeutiky v léčbě nádorových a autoimunitních onemocnění. Jejich komplexní struktura, heterogenita post-translačních modifikací a disulfidové mosty vyžadují analytické metody schopné poskytovat informace o intact masě, sekvenci a PTM bez rozsáhlé přípravy vzorku. Native top-down mass spectrometrie umožňuje charakterizaci celých protilátek v nativním stavu, což zkracuje analýzu, zachovává biologickou strukturu a nabízí rychlou cestu k monitoringu kvality v bioprodukci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit výkon nového Orbitrap Eclipse Tribrid quadrupole-Orbitrap linear ion trap mass spektrometru v nativní top-down analýze intact protilátek. Autoři zkoumali trastuzumab (Herceptin) za nativních i denaturačních podmínek při použití čtyř repertoárů disociačních technik: vysokoenergetického kolizního rozkladu (HCD), elektronového přenosu (ETD), kombinovaného EThcD a fotonové disociace UVPD. Studie porovnávala pokrytí sekvence, typy fragmentů a overlapy mezi lehkým a těžkým řetězcem.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Herceptin (trastuzumab) buffer exchange do 200 mM amoniakálního acetátu (Micro Bio-Spin 6).
• Koncentrace 2 µg/µl v roztoku 20 mM amoniakálního acetátu nebo 1:1 acetonitril: voda + 0,1 % kyselina mravenčí.

Instrumentace:

• Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid MS v režimu High Mass Range MSn (HMRn) s přímou infuzí ESI.
• Fragmentační techniky: HCD, ETD, EThcD a UVPD.
• Izolace iontů lehkého řetězce (27+) a těžkého řetězce (49+) v lineárním iontovém trapu do m/z 8 000.

Software pro analýzu:

• BioPharma Finder 3.1, TD Validator, Xtract a ProSight Lite.

Hlavní výsledky a diskuse

Native podmínky:

• Sledované intact Herceptin generovalo kombinované sekvenční pokrytí ~43 % (HCD, ETD, EThcD, UVPD).
• Lehký řetězec dosáhl ~47 % pokrytí, těžký řetězec ~36 %.

Denaturační podmínky:

• Sekvenční pokrytí ~39,7 % s podobným fragmentačním repertoárem.

Kombinovaná analýza native + denaturovaných vzorků:

• Celkové pokrytí sekvence se zvýšilo na ~53,3 %, lehký řetězec na 67,9 % a těžký řetězec na 46,4 %.
• Vennovy diagramy ukázaly unikátní i překrývající se fragmenty mezi podmínkami a řetězci.

Diskuse:
Multimodální disociační přístupy přinášejí lepší proteomické pokrytí intact protilátek než jednotlivé techniky. Výhoda nativního přístupu spočívá v zachování strukturálních vazeb a snížení vzorkových úprav.

Přínosy a praktické využití metody

Native top-down analýza intact protilátek umožňuje:

• Rychlé stanovení molekulární hmotnosti a variant glykosylace bez sekvenčních digescí.
• Mapování disulfidových vazeb a detekci post-translačních modifikací in situ.
• Implementaci do QC procesů biofarmaceutické výroby pro kontrolu konzistence a identity produktu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Zvýšení sekvenčního pokrytí díky vylepšené citlivosti a dalším disociačním režimům (např. kombinace s ion mobility).
• Automatizace náběrů a zpracování dat pro vysokopropustné nasazení ve výzkumu i průmyslu.
• Rozšíření aplikace na bispecifické protilátky, fúzní proteiny a komplexní biologika s heterogenními modifikacemi.

Závěr

Studie prokázala excelentní výkon Orbitrap Eclipse Tribrid MS pro nativní top-down analýzu intact protilátek. Kombinace HCD, ETD, EThcD a UVPD poskytla robustní sekvenční pokrytí, zachování strukturálních prvků a potenciál pro rychlou kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

• Damoc E., Srzentić K., Huguet R., McAlister G., Mullen C., Remes P. M., Canterbury J. D., Senko M., Zabrouskov V. Native Top-Down Analysis of Intact Antibodies using Multiple Dissociation Techniques on a Tribrid Quadrupole Orbitrap Linear Ion Trap Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific, 2019.