Influence of Ion Storage Location and Multiple Fill/Laser Pulse Sequence on Top-down UVPD Using an Orbitrap Fusion Mass Spektrometer

Význam tématu

Ultrafialová fotodissociace (UVPD) nabízí v top-down proteomice schopnost generovat vysoce informativní polypeptidové fragmenty pro detailní sekvenční pokrytí a analýzu modifikací. Díky využití 193nm excimerového laseru lze minimalizovat závislost sekvenčního pokrytí na náboji, zachovat křehké post-translační modifikace a dosáhnout vysoké citlivosti v rámci Orbitrap Fusion systému.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na hodnocení výkonu UVPD reaktivity v rámci tří iontových úložišť (HPC, LPC, IRM) na Orbitrap Fusion Tribrid spectrometru. Cílem bylo porovnat sekvenční pokrytí, počet fragmentních iontů a vliv počtu iontových nabití a laserových pulzů na kvalitu výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Modelovým analytem byla apomyoglobin (Sigma Aldrich) připravený v 49:49:2 H2O:Methanol:Acetic Acid při 0,5 μM. Fragmentace probíhala v 193 nm ArF excimerovém laseru Coherent ExciStar XS (5 ns, 0,4–60 mJ/pulz) upraveném do infračerveného okénka LPC. Aktivace vzorku byla prováděna v nízkotlaké (LPC) a vysokotlaké cévce (HPC) i v infračervené aku­mu­laci (IRM). Data byla dekonvoluována pomocí Hardklor a identifikována v Prosight Lite.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Lokalita UVPD: Nejstabilnější sekvenční pokrytí a pomalejší pokles kvality fragmentace při zvyšující se energii vykazoval HPC oproti LPC. IRM umožňuje flexibilní umístění, avšak vyžaduje přesné seřízení laseru.
2) Počet pulzů a iontové plnění: Vícenásobné plnění iontů (1–5×) a vícenásobné laserové pulzy (1–5 pulzů) ukázaly, že optimalizovaný postup 1× iontové plnění a 5 pulzů při ~0,6 mJ poskytuje maximální hustotu fragmentních iontů a nejvyšší sekvenční pokrytí.
3) Energetická závislost: Depletace prekurzoru se řídí exponenciální kinetikou první řádu. Při energiích nad 1 mJ se objevuje přemíra fragmentace a ztráta středních fragmentů.
4) Řízení nadfragmentace: Rezonanční dipólová excitace dokáže odsunout prekurzor z laserové dráhy a zajistit selektivní UVPD bez CID artefaktů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké sekvenční pokrytí komplexních proteinů v top-down módu.
• Zachování křehkých modifikací díky krátkým UV pulzům.
• Možnost rychlé optimalizace pomocí různých úložišť a pulzních schémat bez přerušení vakua.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace UVPD do rutinních workflow v proteomice a farmaceutické kvalitě.
• Automatizace nastavení laserové energie a pulzních sekvencí s využitím strojového učení.
• Kombinace UVPD s dalšími aktivacemi (EThcD, HCD) pro rozšířené pokrytí a validaci PTM.

Závěr

Orbitrap Fusion Tribrid vybavený 193nm excimerovým laserem pro UVPD poskytuje robustní a flexibilní platformu pro top-down analýzu proteinů. Vysokotlaké varné úložiště (HPC) se ukázalo jako optimální pro vyvážené sekvenční pokrytí a kontrolu fragmentace. Kontrola nad amplifikací pulzů a ochranou fragmentů je klíčová pro reprodukovatelné výsledky.

Reference

1. Shaw JB et al., J. Am. Chem. Soc., 2013, 135(34), 12646–12651
2. Hoopmann MR et al., Anal. Chem., 2007, 79, 5630–5632
3. Fellers RT et al., Proteomics, 2015, 15(7), 1235–1238
4. Holden DD et al., Poster presented at 62nd ASMS Conference, Baltimore, MD (2014)