Implementation of 213 nm Ultra Violet Photodissociation (UVPD) on a Modified Orbitrap Fusion Lumos

Význam tématu

Ultrafialová fotodissociace (UVPD) při vlnové délce 213 nm představuje moderní přístup v hmotnostní spektrometrii pro detailní rozkládání peptidových a proteinových kationtů. Díky schopnosti navozovat všechny typy štěpení hlavního řetězce (a, b, c, x, y, z ionty) a zachovávat labilní posttranslační modifikace (fosforylace, sulface, glykosylace) se UVPD stává klíčovou metodou v top-down proteomice a charakterizaci bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje podrobnou implementaci 213 nm UVPD modulu na platformu Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos. Cílem je demonstrovat mechanické řešení integrace laseru, dlouhodobou stabilitu, instrumentální parametry a výkonnost při sekvenování celých proteinů. Navazuje na předchozí výsledky Weisbroda et al. (2016) a rozšiřuje je o top-down aplikace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky

• Apomyoglobin (16,8 kDa) a bovinní karbonická anhydráza II (29 kDa), 1 pmol/μL v 50/50 MeOH/H₂O s 0,1 % formičnou kyselinou
• Infuze při 3 μL/min s přednastavenými AGC cíli 5×10⁵, rozlišení Orbitrap 120 000, průměr 100 uScan, IRM 3,0 mTorr

Laser a optika

• CryLaS Q3 Nd:YAG laser, 5. harmonická (213 nm), průměrný výkon 3,75 mW (±0,5), pulzní energie 1,5 μJ (±0,2), opakovací frekvence 2,5 kHz, šířka pulzu <1 ns
• Optická cesta z UV-grade křemenného skla, zrcadla s UV povlakem, vakuová přechodová komora na zadním flanži lineárního iontového filmu

Detekce a zpracování dat

• Disociace probíhá v nízkotlakém článku duálního čtyřpólového lineárního iontového pastu
• Analýza fragmentů v iontové pasti nebo Orbitrap analyzátoru
• Dekonvoluce spekter pomocí Hardklör a vyhledávání v ProSight Lite s tolerancí 10 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

Integrace laseru vykazuje vynikající dlouhodobou stabilitu provedenou měřením překryvu paprsku s iontovým mračnem a hodnocením Alignment Quality Score (AQS ≈ 0,5). Optimální počet pulzů a doba aktivace vedou k sekvenčnímu pokrytí ~55 % pro apomyoglobin a ~30 % pro karbonickou anhydrázu, překonávající nebo doplňující ETD, CID a HCD. Kombinované metody dosahují celkové pokrytí významně nad 90 %, což podtrhuje unikátní sekvenční informaci z UVPD.

Přínosy a praktické využití metody

Robustní a kompaktní uspořádání laseru umožňuje rutinní UVPD aktivaci na Orbitrap Fusion Lumos. Metoda je zvláště přínosná pro top-down charakterizaci intact proteinů, detailní mapování PTM a analýzu bioterapeutik, kde je vyžadována vysoká sekvenční pokrytí a minimalizace ztrát labilních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj očekává automatizaci alignmentu laseru, vyšší výkon a kratší doby aktivace, integraci s mikrofluidickými platformami, paralelní workflow a pokročilé bioinformatické nástroje pro rychlé zpracování top-down dat. Rozšíření na větší proteiny a komplexní proteinové komplexy otevře nové možnosti v proteomu lidských buněk a industriální analytice.

Závěr

Implementace 213 nm UVPD na upravený Orbitrap Fusion Lumos demonstrovala mechanickou stabilitu, reprodukovatelnost a vysokou sekvenční výkonnost pro intact proteiny. Metoda významně rozšiřuje analytické možnosti top-down proteomiky a nabízí výhody při zachování labilních modifikací a získávání bohatých sekvenčních informací.

Reference

1. Broadbelt JS. Ion Activation for Peptides and Proteins. Anal Chem. 2016;88:30–51.
2. Shaw JB, Li W, Holden DD, Zhang Y, et al. Complete protein characterization using top-down mass spectrometry and ultraviolet photodissociation. J Am Chem Soc. 2013;135:12646–12651.
3. Cleland TP, DeHart CJ, Fellers RT, et al. High-throughput analysis of intact human proteins using UVPD and HCD on an Orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res. 2017;15(5):2072–2079.
4. Weisbrod CR, Zhuk E, Dunyach JJ, Schwartz JC. Performance considerations for ultraviolet photodissociation using the Nd:YAG 5th harmonic (213 nm). ASMS 2016;ThOB 10:10 am.
5. Hoopman MR, Finney GL, MacCoss MJ. High-speed data reduction, feature detection, and MS/MS spectrum quality assessment of shotgun proteomics data sets using high-resolution mass spectrometry. Anal Chem. 2007;79(15):5620–5632.
6. Fellers RT, Greer JB, Early BP, Yu X, LeDuc RD, Kelleher NL. ProSight Lite: Graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 2015;15(7):1235–1238.