Revolutionizing Data Independent Acquisition on q-OT-IT Tribrid Mass Spectrometers

Význam tématu

Data Independent Acquisition (DIA) na moderních kvadrupól-Orbitrap-Ion Trap tribridových sériích masových spektrometrů přináší výrazné zlepšení citlivosti, reprodukovatelnosti a hloubky kvantifikace komplexních proteomových vzorků. Tato metoda umožňuje retrospektivní analýzu dat a komplexní profilování proteinů bez potřeby předběžného výběru analyzovaných peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat aplikaci DIA pro úplnou kvantifikaci celokompletní trezlyzátu buněk plicního karcinomu odolných vůči Erlotinibu ve srovnání s citlivou linií. Pro konstrukci rozsáhlé spektrální knihovny byly použity DDA experimenty na buněčných lysátech, načež následovala analýza DIA na dvou generacích tribridních Orbitrap přístrojů.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: redukce, alkylace, tryptické štěpení, doplnění Biognosys HRM kitu jako interní standard.
• Chromatografie: Easy nLC 1000, reverzní fázová kolona PepMap C18 (75 µm × 500 mm), gradient 5–25 % B během 120 min a 25–40 % B během 35 min při 300 nl/min, fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, B: 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu.
• Masová spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Fusion a Orbitrap Fusion Lumos, MS1 plné spektrum 120 000 FWHM, DIA se 40 sekvenčními MS/MS okny šířky 15 Da (400–1000 m/z) při rozlišení 30 000, maximální injekční čas 60 ms.
• Analýza dat: Spectronaut 7 (Biognosys) pro DIA, Proteome Discoverer 1.4 se SEQUEST HT a Percolator pro DDA, úsťování na lidské Swiss-Prot databázi, FDR 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo kvantifikováno přes 5200 proteinových skupin a 44 000 jedinečných peptidů s mediánem koeficientu variační 9,2 % a reprodukovatelností lepší než 80 % pokrytí spektrální knihovny. Orbitrap Fusion Lumos poskytl o 25 % více kvantifikovaných proteinů a o 30 % více peptidů při 100 ng naložení na kolonu ve srovnání s předchozí generací. Identifikováno bylo téměř 1200 proteinů s ≥2× změnou exprese (p<0,01). Výsledky DIA korelovaly úzce s orthogonálními metodami (TMT, SILAC). V rezistentních buňkách došlo k poklesu exprese klíčových kináz MAPK cesty a nárůstu proteinů mTOR signální dráhy.

Přínosy a praktické využití metody

DIA na tribridních Orbitrap přístrojích umožňuje rychlou a hlubokou proteomickou analýzu celých buněčných lysátů bez potřeby cíleného excerpčního protokolu. Metoda je vhodná pro objev biomarkerů, sledování rezistence vůči lékům a kvalitativní/kvantitativní kontrolu ve farmacii a biotechnologiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zkrácení analytického času, nasazení ještě užších izolačních oken, rozšíření multiplexních kvantifikačních přístupů, aplikace na klinické vzorky a integrace umělé inteligence pro hlubší biologickou interpretaci dat představují klíčové směry rozvoje.

Závěr

Série Orbitrap Fusion Lumos v režimu DIA ukázala výrazné zlepšení citlivosti, hloubky a reproducibility proteomického měření. Díky zvýšenému počtu identifikací a rychlému zpracování dat je tento přístup perspektivní pro široké uplatnění ve výzkumu i rutinní analytice.

Reference

• Bomgarden et al. Cancer Res. 2014;74:1608.
• Senko et al. Anal. Chem. 2013;85:11710–11714.
• Bruderer et al. Mol. Cell. Proteomics. 2015;Epub ahead of print.