Pushing the Limits of Bottom-Up Proteomics with State-Of-The-Art Capillary UHPLC and Orbitrap Mass Spectrometry for Reproducible Quantitation of Proteomes

Význam tématu

Bottom-up proteomika představuje klíčový přístup pro identifikaci a kvantifikaci proteinů v komplexních biologických vzorcích. Zlepšení separační kapacity kapilární UHPLC a výkonnosti hmotnostních analyzátorů umožňuje dosáhnout hlubšího průzkumu proteomu, vyšší reprodukovatelnosti a citlivosti, což je zásadní pro výzkum buněčné biologie, klinické proteomiky a personalizovanou medicínu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo porovnat výkonnost nového systému Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1200 v kombinaci s Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ hmotnostním spektrometrem při separaci HeLa buněčného lyzátu na 50 cm a 75 cm dlouhých kapilárách s gradienty 2 a 4 hodin. Studie se zaměřila na zvýšení počtu identifikovaných a kvantifikovaných peptidů a proteinů, hodnocení reprodukovatelnosti a optimalizaci analytického pracovního postupu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: tryptické štěpení HeLa proteinu (1–2 µg) s přídavkem PRTC standardů.
Chromatografie:

• UHPLC: Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1200, provozní tlak až 1200 bar, teplota kolony 55 °C.
• Kapilární kolony EASY-Spray Acclaim PepMap C18, 75 µm × 50 cm a 75 µm × 75 cm, částice 2 µm.
• Gradienty: 120 min (5–28 % B), 240 min (5–28 % B) při 300 nL/min.

Hmotová spektrometrie:

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid: survey skeny 375–1575 m/z při 120 000 FWHM, MS/MS CID v iontové pastičce, cyklus 3 s, izolace 1,2 Th, dynamické vyloučení 12 s.

Datová analýza:

• Proteome Discoverer 2.1 s SEQUEST HT a Percolator (1 % FDR), kvantifikace Precursor Ions Area Detector, DAnTE, Skyline pro hodnocení FWHM, CV a peak capacity.

Hlavní výsledky a diskuse

Delší 75 cm kolona vykázala vyšší peak capacity (>800 při 240 min gradientu) a umožnila identifikaci o 10 % více unikátních peptidů a o 7 % více proteinů než 50 cm kolona při 4 h gradientu. Reprodukovatelnost mezi technickými replikáty překročila 95 % sdílených identifikací a CV retence peptidů zůstaly pod 1 min. Počet kvantifikovatelných peptidů se zvýšil o 20 % a korelace mezi běhy dosáhla >85 %. Zvýšení naloženého množství z 1 µg na 2 µg zlepšilo reprodukovatelnost (korelace až 89 %) a zvýšilo podíl proteinů s CV pod 5 %.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný workflow umožňuje hlubokou a reprodukovatelnou analýzu proteomu bez předchozí frakcionace, čímž zkracuje dobu analýzy a zjednodušuje přípravu vzorku. Výsledky jsou relevantní pro vysoce průtokové studie, klinické aplikace a výzkum personalizované medicíny.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zlepšení lze očekávat v oblasti ještě delších kapilár, menších částic či vyšších pracovních tlaků. Kombinace s technikami data independent acquisition (DIA), automatizací a integrací více typů omických dat nabízí další zvětšení hloubky a spolehlivosti proteomických analýz.

Závěr

Spolupráce UHPLC systému EASY-nLC 1200 s Orbitrap Fusion Lumos vede k významnému nárůstu identifikací i kvantifikace proteinů, lepší reprodukovatelnosti a vyšší efektivitě. Tento přístup stanovuje nový standard pro kvantitativní bottom-up proteomiku a napomáhá pokroku v biologickém a klinickém výzkumu.

Reference

1. Wilhelm M, et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 2014;509(7502):582–587.
2. Hebert AS, et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 2014;13(1):339–347.
3. Wu X, et al. Global phosphotyrosine survey in triple-negative breast cancer. Oncotarget. 2015;Epub ahead of print.
4. Livesay EA, et al. Fully automated four-column capillary LC-MS. Anal Chem. 2008;80(1):294–302.
5. Cox J, Mann M. Quantitative, high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 2011;80:273–299.
6. Scigelova M, et al. Fourier transform mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 2011;10(7):M111.009431.
7. Hsieh EJ, et al. Effects of column and gradient lengths on peak capacity. J Am Soc Mass Spectrom. 2013;24(1):148–153.
8. Köcher T, et al. Ultralow flow nanoliquid chromatography-tandem mass spectrometry. Proteomics. 2014;14(17–18):1999–2007.
9. Käll L, et al. Semi-supervised learning for peptide identification. Nat Methods. 2007;4(11):923–925.
10. Polpitiya AD, et al. DAnTE: a statistical tool for quantitative analysis of -omics data. Bioinformatics. 2008;24(13):1556–1558.
11. MacLean B, et al. Skyline: an open source document editor. Bioinformatics. 2010;26(7):966–968.
12. Shen Y, et al. Automated 20 kpsi RPLC-MS and MS/MS. Anal Chem. 2005;77(10):3090–3100.