Optimization of RP-LC-MS Top-down Protein Analysis on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS with the Advanced Peak Determination Algorithm

Význam tématu

Top-down proteomika umožňuje studium intact proteinů a jejich proteoform, ale tradiční datově závislá LC-MS workflow trpí sníženou účinností kvůli rozptýlení signálu do mnoha nábojových stavů a omezenému přiřazení nábojů v reálném čase.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje nový algoritmus Advanced Precursor Determination (APD) implementovaný v Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS. Hlavním cílem bylo porovnat standardní detekci předkurzorů (SPD) s APD v režimech low-high a high-high pomocí komerční proteinové směsi a složitějšího E.coli lyzátu a vyhodnotit dopad APD na efektivitu datově závislého sběru dat.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Pierce Intact Protein Standard Mix (6 proteinů, 9–68 kDa)
• E.coli lyzát (1 µg µl⁻¹ ve 0,1% formiové kyselině)

Chromatografie:

• Vanquish UHPLC s MAbPac RP kolónou
• Gradienty 20 a 60 minut při 200 µl/min

MS nastavení:

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS s APD a SPD
• Low-high (MS1 15 000, MS2 120 000 FWHM) a high-high (MS1 i MS2 120 000 FWHM)
• Fragmentace CID, HCD, ETD/EThcD, volitelně UVPD

Hlavní výsledky a diskuse

APD umožnil přesné přiřazení nábojových stavů v reálném čase bez nutnosti povolení neznámých stavů, což eliminovalo redundantní MS2 skeny a zajistilo rovnoměrné rozložení MS1 a MS2 událostí v obou režimech. V analýze Pierce mixu se počet MS2 událostí zvýšil až desetkrát oproti SPD a při E.coli lyzátu byla zachována vysoká frekvence MS2 spuštění i při přísnějších filtračních kritériích.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení duplicitního vyšetřování stejné proteoformy
• Zvýšení počtu unikátních proteoform a PSM
• Hloubkovější analýza komplexních biologických vzorků
• Udržení rychlosti analýzy při vyšší kvalitě dat

Budoucí trendy a možnosti využití

Další integrace pokročilých algoritmů do LC-MS workflow, kombinace APD s dalšími typy fragmentace, škálování na rozsáhlé protéomy komplexních organismů, aplikace v klinické proteomice a studiu posttranslačních modifikací.

Závěr

Algoritmus APD výrazně zvyšuje efektivitu top-down LC-MS analýzy intact proteinů na Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS, což vede k hlubší a rychlejší charakterizaci proteoform bez kompromisů v kvalitě dat.

Reference

• Zabrouskov V.; Fornelli L.; Fellers R.; Srzentic K.; Silveira J.; Cardasis H.; McAlister G.C.; Thoeing C.; Bailey D.; Kuehn A.; Senko M.; Eliuk S.; Huguet R.; Kelleher N. Optimization of RP-LC-MS Top-down Protein Analysis on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS with the Advanced Peak Determination Algorithm.