Quantitative Profiling of DNA Damage Response Proteins Using iTRAQ Labeling and the LTQ Orbitrap XL

Význam tématu

Proteiny podílející se na reakci na poškození DNA (DNA damage response, DDR) udržují stabilitu genomu a jejich nevyvážená regulace je často spojována s nádorovým bujením. Kvantitativní sledování změn v koncentracích těchto proteinů a jejich post-translačních modifikacích, zejména fosforylaci, je klíčové pro pochopení buněčných signálních drah a vývoj nových protinádorových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo identifikovat a relativně kvantifikovat proteiny DDR v lidských nádorových buňkách A549 během 24 hodin po ošetření kamptotecinem. K tomu byly použity 4-plexové iTRAQ značky a vysoce přesná hmotnostní spektrometrie LTQ Orbitrap XL vybavená HCD buněčnou kolizní částí.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky A549 byly ošetřeny 5 μM kamptotecinem a odebrány v časových bodech 0, 2, 8 a 24 hodin. Následovala celková lyze buněk a obohacení fosfoproteinů pomocí specifických sloupců. Vzorky byly redukovány DTT, alkylovány iodoacetamidem, precipitovány acetonem a tráveny trypsinem. Peptidy byly označeny iTRAQ činidly a očištěny C18 fází. Analýza byla prováděna na NanoLC-2D (PepMap C18, 75 μm × 15 cm) s gradientem 5–30 % B během 180 minut (200 nL/min). Hmotnostní spektrometr LTQ Orbitrap XL pracoval s rozlišením 30 000 v MS1 a 7 500 ve HCD MS2, aplikoval top-3 datově závislé HCD a paralelně CID skeny. Data byla vyhodnocena softwary BioWorks 3.3.1 (SEQUEST, PepQuan) a Proteome Discoverer 1.0 (SEQUEST/MASCOT) s využitím iTRAQ reportérových iontů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve vzorcích celkového lyzátu bylo identifikováno 539 proteinů, v obohacené fosfoproteinové frakci 303 proteinů, z nichž 158 bylo sdílených. Po obohacení se podíl fosfoproteinů zvýšil na 90 % a zastoupení kináz vzrostlo z 0,5 % na 4 %. Normalizace iTRAQ signálů byla prováděna pomocí α-tubulinu jako interního standardu. Kinetika změn ukázala v celkovém lyzátu převahu nahoru regulovaných proteinů s vrcholem po 8 hodinách, zatímco ve fosfoproteinové frakci převládalo down-regulace rovněž s maximem v 8. hodině. Další purifikace IMAC umožnila identifikovat a kvantifikovat 30 nových fosforylačních míst na vybraných proteinech (např. HMGA1, TCP4), což zdůrazňuje význam sledování změn na úrovni konkrétních peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Precizní kvantifikace proteinu a fosforylačních míst v komplexních směsích.
• Obohacení fosfoproteinů a fosfopeptidů zvyšuje detekční citlivost.
• Možnost časově rozlišeného sledování odpovědi buněk na chemické agens.
• Užitečné při vývoji protinádorových léčiv, hledání biomarkerů a mapování signálních drah.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace více reverzních a afinitních obohacovacích technik pro zachycení širšího spektra modifikací.
• Zvýšení multiplexního počtu značek nad rámec 4-plexových iTRAQ systémů.
• Využití MS instrumentů s vyšším rozlišením a rychlostí pro zlepšení kvantitativní přesnosti.
• Uplatnění ve studiu dalších typů buněčného stresu či v klinických vzorcích pacientů.

Závěr

Protokol založený na iTRAQ značkách a HCD fragmentaci na LTQ Orbitrap XL umožňuje spolehlivě identifikovat a kvantifikovat stovky DDR proteinů a jejich fosforylační dynamiku v odpovědi na poškození DNA. Kombinace obohacení fosfoproteinů a IMAC purifikace zvýšila detekci mnoha klíčových modifikací, což potvrzuje robustnost metody pro základní i aplikovaný výzkum.

Použitá instrumentace

• NanoLC-2D (Eksigent Technologies) s PepMap C18 kolonu (75 μm × 15 cm)
• LTQ Orbitrap XL s nanospray ionizací a HCD kolizní částí
• Thermo Scientific Phosphoprotein Enrichment Columns a IMAC (Ga-IDA) spin columns
• Thermo Scientific iCON koncentrátor

Reference

• Ashcroft M. et al. Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol. Cell Biol. 1999, 19(3), 1751–1758.
• Saito S. et al. Phosphorylation site interdependence of human p53 post-translational modifications in response to stress. J. Biol. Chem. 2003, 278(39), 37536–37544.
• Zhang T., Viner R., Zabrouskov V. Quantitation of iTRAQ labeled peptides using higher energy collisional dissociation on the LTQ Orbitrap. Thermo Fisher Scientific Application Note #421.
• Matsuoka S. et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science 2007, 316(5828), 1160–1166.
• Jonker H.R.A. et al. Gradual phosphorylation regulates PC4 coactivator function. FEBS J. 2006, 273(7), 1430–1444.