High-Throughput LC-MS/MS Quantification of Pregnenolone in Human Blood Serum for Clinical Research Purposes

Význam tématu

Pregnenolon je biosyntetickou prekurzorovou molekulou pro syntézu klíčových steroidních hormonů (kortikosteroidy, androgeny, estrogens). Jeho přesná kvantifikace v lidské krevní plazmě je zásadní pro výzkum enzymatické aktivity 3β-hydroxysteroiddehydrogenázy a 17α-hydroxylázy a pro studium hormonální rovnováhy v klinických a vědeckých aplikacích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, citlivou a robustní metodu vysokoprůtokové LC-MS/MS analýzy pregnenolonu v lidské krevní séru, schopnou přesné kvantifikace v rozsahu 10–500 ng/dL (0,3–1,5 nmol/L). Metoda byla hodnocena vůči referenční laboratoři a optimalizována pro vysokou průchodnost vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala následující kroky:

• Odběr 200 µL séra, spike s D4-značeným pregnenolonem jako interním standardem.
• Liquid–liquid extrakce s 1 mL methyl-t-butyl etheru.
• Sušení extraktu dusíkem a derivatizace hydroxylaminem vedoucí k tvorbě oximových derivátů.
• Rekonsitituce v metanol–voda 1:1.

Použitá instrumentace

• HPLC: Thermo Scientific Transcend LX-4 multichannel s kolonkou Accucore Phenyl-X (2,6 µm, 50 × 2,1 mm) při 40 °C.
• MS/MS: Thermo Scientific TSQ Endura triple quadrupole se HESI ionizačním zdrojem (+3500 V, 400 °C).
• Software pro sběr a vyhodnocení dat: Thermo Scientific TraceFinder.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Lineární odpověď r2 ≥ 0,999 v rozsahu 10–500 ng/dL s 1/X vážením.
• Celoživotní přesnost mezilaboratorních a intralaboratorních měření (%CV) < 8 % a nosičnost < 0,2 %.
• Obnova interního standardu průměrně 65 % kompenzující matrixové efekty.
• Porovnání s referenční laboratoří u 40 pacientských vzorků ukázalo ≤ 20% rozdíl ve 92,5 % případů.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody této LC-MS/MS metody zahrnují:

• Vysokou citlivost a selektivitu pro nízké koncentrace pregnenolonu.
• Krátký analytický běh (4,5 min) a možnost multichannel provozu až 52 injekcí/hodinu.
• Spolehlivou kvantifikaci s využitím ion-ratio potvrzení.

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze očekávat:

• Rozšíření panelů steroidů pomocí stejné derivatizační strategie a multichannellingu.
• Automatizaci přípravy vzorků pro zvýšení reproducibility a throughput.
• Integraci s lékařskými datovými platformami pro personalizovanou medicínu.

Závěr

Popsaná metoda představuje efektivní a robustní nástroj pro klinický výzkum steroidních prekurzorů, umožňující přesnou a rychlou kvantifikaci pregnenolonu v krevní séru. Je vhodná pro laboratoře orientované na vysokou průchodnost a spolehlivost výsledků.

Reference

1. Kushnir M.M. et al. Development and performance evaluation of a tandem mass spectrometry assay for 4 adrenal steroids. Clin Chem. 2006;52:1559–1567.