High-Throughput LC-MS/MS Quantification of 17-Hydroxyprogesterone (17-OHP) in Human Blood Serum for Clinical Research Purposes

Význam tématu

17-hydroxyprogesteron (17-OHP) je klíčový steroidní prekurzor zapojený do syntézy kortikosteroidů, androgenů i estrogenů. Jeho kvantifikace v lidském séru umožňuje sledovat aktivitu enzymů 21-alfa hydroxylázy a 17,20-lyázy, což má význam v endokrinologickém výzkumu a klinických studiích poruch nadledvin.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlou, spolehlivou a robustní LC-MS/MS metodu s vysokým průtokem pro kvantifikaci 17-OHP v lidském krevním séru v rozsahu 10–1000 ng/dL. Metoda byla validována pro linearitu, přesnost, rozpětí i mezní hodnoty a porovnána s referenční laboratoří.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky obsahující 200 µL séra byly obohaceny o deuterovaný interní standard, extrahovány methylterc-butyletherem, vysušeny proudem zahřátého dusíku a rekonstituovány ve směsi vody a methanolu (1:1). Následovala reverzní chromatografie na kolóně Accucore RP-MS (2,6 µm, 50 × 2,1 mm) pomocí gradientní eluce vody a methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí. Detekce probíhala na triplekvadrupolárním MS s APCI ionizací v režimu SRM.

Použitá instrumentace

• HPLC systém Thermo Scientific Transcend LX-4 multikanál
• Kolona Thermo Scientific Accucore RP-MS 2,6 µm, 50 × 2,1 mm
• MS/MS detektor Thermo Scientific TSQ Endura s APCI zdrojem
• Software Thermo Scientific TraceFinder pro akvizici a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykazovala v rozsahu 10–1000 ng/dL vynikající linearitu (r2 ≥ 0,999 s 1/X vážením), mez nosnosti potvrzenou na 10 ng/dL. Mezi- a nitrobatchová přesnost byly lepší než 6 % a mez nosnost přenosu (carryover) pod 0,1 %. Poměry kvantifikačních a potvrzovacích iontů zůstaly v rámci ±20 % stanovených průměrů. Obnova interního standardu se pohybovala okolo 87 % s RSD 20 %. Srovnání s výsledky referenční laboratoře na 40 vzorcích ukázalo, že pro 95 % vzorků byla rozdílnost do 20 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza se zkrácenou dobou běhu 4 minuty na vzorek
• Vysoká propustnost až 56 injekcí/h při použití 4 kanálů
• Vysoká citlivost a přesnost v širokém rozmezí koncentrací
• Možnost multikanálového provozu s jinými metodami APCI

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky mohou být integrace do rutinního klinického monitoringu poruch steroidogeneze, automatizace přípravy vzorků a rozšíření metody o další steroidy pro komplexní profilování endokrinních onemocnění. Vývoj v citlivějších ionizačních technikách a rychlejších hmotnostních analyzátorech může dále zvýšit propustnost a snížit objem vzorku.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda nabízí citlivé, spolehlivé a vysoce výkonné řešení pro kvantifikaci 17-hydroxyprogesteronu v lidském séru. Díky vynikající přesnosti, nízkému carryover a vysoké propustnosti je vhodná pro klinický výzkum a potenciálně pro rutinní diagnostiku endokrinních onemocnění.