ICSialic Acid Determination in Glycoproteins: Comparison of Two Liquid Chromatography Methods

Význam tématu

Sialové kyseliny v glykoproteinech ovlivňují biologickou dostupnost, stabilitu, farmakokinetiku a imunogenní potenciál terapeutických proteinů. Rozlišení Neu5Ac a Neu5Gc je klíčové kvůli přítomnosti protilátek vůči Neu5Gc u člověka.

Cíle a přehled studie

Cílem je porovnat dvě chromatografické metody pro kvantifikaci Neu5Ac a Neu5Gc ve vybraných modelových glykoproteinech. Metody zahrnují HPAE-PAD a UHPLC-FLD s předchozí kyselou hydrolýzou nebo enzymatickou digestí a DMB derivatizací.

Použitá metodika a instrumentace

• Kyselá hydrolýza podle Varki et al. pro zachování O-acetylovaných forem
• Digest neuraminidázou pro selektivní uvolnění sialových kyselin
• DMB derivatizace za silně kyselých podmínek
• HPAE-PAD na Dionex ICS-3000/5000 se SP nebo DP pumpou, elektrochemickým detektorem a jednorázovou zlatou elektrodou
• UHPLC-FLD na Dionex UltiMate 3000 RSLC s pumpou HPG, autosamplerem, kapilárovou sadou Viper a detektorem s duálním PMT

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě metody detekují Neu5Ac a Neu5Gc s obdobnou liniaritní, LOD, LOQ, přesností a správností
• HPAE-PAD umožňuje přímou detekci bez derivatizace a je kompatibilní s enzymatickou digestí
• UHPLC-FLD vyžaduje časově náročnou derivatizaci a přípravu standardů ve stejném matrice
• Metoda UHPLC-FLD může vykazovat interferenční píky z reagenčních komponent
• Neu5Gc nebyl detekován v lidských transferrinu ani AGP, u ostatních glykoproteinů byly naměřené hodnoty srovnatelné oběma přístupy

Přínosy a praktické využití metody

• HPAE-PAD nabízí rychlou a přímou analýzu s nízkou komplexitou přípravy
• UHPLC-FLD poskytuje vysokou citlivost a selektivitu po optimalizaci derivatizace
• Výběr metody lze přizpůsobit požadavkům na matrice vzorku, dobu analýzy a dostupné instrumentální vybavení

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a miniaturizace kapilárních systémů pro rychlejší analýzu
• Vývoj nových derivatizačních činidel pro širší rozsah sialových kyselin
• Integrace hmotnostní detekce pro potvrzení struktur
• Online digesce a derivatizace v rámci jediného workflow

Závěr

Obě chromatografické metody jsou vhodné pro rutinní stanovení sialových kyselin v terapeutických glykoproteinech. Volba metody závisí na požadované rychlosti, citlivosti a kompatibilitě se vzorkovou matricí.

Reference

1. Varki A., Diaz S. Anal. Biochem. 1984, 137:236–247.
2. Fan J.Q., Namiki Y., Matsuoka K., Lee Y.C. Anal. Biochem. 1994, 219:375–378.
3. Rohrer J.S. Anal. Biochem. 2000, 283:3.
4. Hara S., et al. Anal. Biochem. 1989, 179:162.
5. Dionex Corporation. Direct Determination of Sialic Acids in Glycoprotein Hydrolyzates by HPAE-PAD. Application Update 180, 2011.
6. Dionex Corporation. UHPLC Determination of Sialic Acids with Fluorescence Detection. Application Note 278, 2011.