Monosaccharide and Sialic Acid Determinations in Biosimilars Using HPAE-PAD

Význam tématu

Glykozylace je klíčová posttranslační modifikace glykoproteinů, která ovlivňuje jejich stabilitu, biologickou aktivitu, farmakokinetiku a imunogenicitu. V kontextu rozvoje biosimilárních terapeutických proteinů je přesná charakterizace monosacharidů a sialových kyselin nezbytná pro potvrzení strukturní a funkční ekvivalence s referenčními produkty.

Cíle a přehled studie

Cílem přehledu je představit aplikace vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) pro stanovení monosacharidů a sialových kyselin v glykoproteinech. Předkládané příklady zahrnují analýzu fukózy, glukosaminu, galaktózy, glukózy, mannózy, a sialových kyselin Neu5Ac a Neu5Gc v různých vzorcích, včetně terapeutické imunoglobuliny G, fetuinu, alfa-1-kyselého glykoproteinu, transferrinu a PSA.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci sacharidů byly aplikovány tyto technologie:

• Vysokoúčinná aniontová výměnná chromatografie (HPAE) na kolonkách Thermo Scientific Dionex CarboPac PA20 (analytické i fast verze) s uloženou stacionární fází na bázi křížově vázaných mikroperliček.
• Generace elučního roztoku elektrolyticky pomocí Thermo Scientific Dionex EGC III KOH Cartridge a CR-ATC trap column.
• Pulsní amperometrická detekce (PAD) s nespotřebními zlatými PTFE elektrodami a referenční Ag/AgCl elektrodou pro přímé, vysoce selektivní a citlivé měření neodvodněných sacharidů.
• Chromatografické systémy Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC a ICS-4000 Capillary HPIC pro standardní i kapilární průtokové režimy s bezkovovými PEEK cestami a možností quaternárních gradientů.
• Nízkoodpadové kapilární metody využívající kolony o průměru 0,4 mm pro analýzu limitovaných vzorků (<10 µg proteinu).

Hlavní výsledky a diskuse

Analytické metody pro monosacharidovou a sialovou charakterizaci prokázaly:

• Vysoké rozlišení pěti hlavních monosacharidů (fukóza, glukosamin, galaktóza, glukóza, mannóza) s reprodukovatelnými retenčními časy a stabilitou signálu po stovky analýz.
• Specifickou separaci Neu5Ac a Neu5Gc v časech analýzy 9–16 minut s lineární detekční křivkou, přesností lepší než 5 % a schopností detekce nízkých pmol množství.
• Možnost stanovit sialylaci i na limitovaných vzorcích (např. PSA) kombinací kyselého hydrolyzátu a enzymatické digesce.
• Robustnost metody díky jednorázovým Au/PTFE elektrodám, minimalizaci driftu a rychlé re-equilibraci chromatografického systému.

Přínosy a praktické využití metody

Metody HPAE-PAD v praxi umožňují:

• Bezderivátovou detekci sacharidů šetřící čas, náklady a expozici škodlivým činidlům.
• Ultra­selektivní a vysoce citlivé stanovení s minimálními interferencemi matrice.
• Rychlé analýzy s vysokým rozlišením při zachování kapacity zátěže systému.
• Efektivní kontrolu kvality glykozylace během vývoje a výroby biosimilárních proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává v těchto oblastech:

• Miniaturizace kapilární a mikrofluidní chromatografie pro analýzu sub­mikrogramových množství vzorků.
• Integrace elektrolytické generace eluenta s online úpravou pH pro automatizované výměnné glykobiologické platformy.
• Vývoj nových pracovních elektrod a vlnových forem pro rozšíření detekce dalších glykanů a lipido­karbo­hydrátů.
• Kombinace HPAE-PAD s hmotnostní spektrometrií pro strukturální charakterizaci oligosacharidů a potranslačních modifikací.

Závěr

HPAE-PAD představuje osvědčenou, vysoce výkonnou a spolehlivou metodu pro kvantitativní analýzu monosacharidů a sialových kyselin v glykoproteinech. Díky přímé detekci, vysoké citlivosti a robustnosti je nepostradatelná při vývoji a výrobě biosimilárních terapeutik.

Reference

1. Technical Note 40: Glycoprotein Monosaccharide Analysis Using HPAE-PAD with Eluent Generation, Thermo Scientific.
2. Application Update 181: Rapid Screening of Sialic Acids in Glycoproteins by HPAE-PAD, Thermo Scientific.
3. Application Note 1050: Evaluating Protein Glycosylation in Limited-Quantity Samples by HPAE-PAD, Thermo Scientific.
4. Application Update 180: Direct Determination of Sialic Acids in Glycoprotein Hydrolyzates by HPAE-PAD, Thermo Scientific.