Determination of glycoprotein sialic acid composition using HPAE-PAD in dual eluent generation cartridge mode

Význam tématu

Analýza složení k kyselin sialových v glykoproteinech je klíčová pro určení kvality a bezpečnosti terapeutických proteinů. Sialylace ovlivňuje cirkulační poločas, biologickou aktivitu a rozpustnost glykoproteinů a přítomnost Neu5Gc může vyvolat imunitní odpověď u člověka.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikačního protokolu bylo ověřit možnost stanovení Neu5Ac a Neu5Gc pomocí HPAE-PAD na koloně Thermo Scientific Dionex CarboPac PA20 formátu 1×150 mm s elektrolyticky generovaným eluentem (dual EGC režim), a to s významnou úsporou eluentu a automatizací přípravy roztoku.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval:

• Hydrolýzu glykoproteinů 2 M kyselinou octovou při 80 °C po dobu 3 h.
• Odpaření hydrolyzátu ve SpeedVac a rekonstituci ve vodě.
• Kromatografii: CarboPac PA20 guard (1×30 mm) + separační kolona (1×150 mm), teplota 30 °C, průtok 0,056 mL/min.
• Elektrochemická detekce s pulzním amperometrickým vlnovým průběhem (gold on PTFE elektrodový systém).
• Dual eluent generation cartridge režim: EGC MSA + EGC KOH pro automatické tvorení gradientu KOH/KMSA bez manuálního míchání.

Klíčová přístrojová zařízení:

• Dionex ICS-6000 HPIC systém s elektrochemickým detektorem
• CarboPac PA20-1 mm kolona
• EGC 400 KOH a EGC 400 MSA cartridgy
• SpeedVac SPD 140DDA, Nanodrop 2000c, Dri-Bath blok

Hlavní výsledky a diskuse

Systém poskytl baseline separaci Neu5Ac (4,07 min) a Neu5Gc (13,97 min) s návratem kolony do výchozího stavu během 30 min.
Linearity kalibrací pro Neu5Ac (0,1–25 µM) i Neu5Gc (0,025–2,5 µM) vykázala r2 > 0,999. Detekční meze (S/N = 3) dosáhly 20,9 nM Neu5Ac (8,36 fmol) a 10,3 nM Neu5Gc (4,13 fmol).
Přesnost (RSD) retenčních časů < 0,2 %, plošné přesnosti mezi dny 0,83–1,04 %, recovery spike-testů 95–105 %.
Stabilita retenčních časů byla prokázána po 15 dnech kontinuálních injekcí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda významně zjednodušuje rutinní analýzu sialových kyselin:

• Automatizovaná příprava eluentu eliminuje zdroje chyb a snižuje spotřebu chemikálií.
• Vysoká přesnost a reprodukovatelnost umožňuje aplikace v QA/QC výrobě bioterapeutik.
• Nízký průtok (0,056 mL/min) snižuje provozní náklady.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody o:

• Online enzymatickou či chemickou hydrolýzu glykoproteinů integrovanou v chromatografické rámci.
• Rozšíření na další deriváty sialových kyselin a komplexní glykanové profily.
• Miniaturizaci a automatizaci přípravy vzorku s robotickými moduly.
• Integraci s hmotnostní detekcí pro strukturové určení glykanů.

Závěr

Implementace HPAE-PAD na koloně CarboPac PA20-1 mm v dual EGC režimu prokázala plnou srovnatelnost s tradičními metodami s manuálním mícháním eluentu při výrazném zjednodušení provozu a úspoře eluentu. Metoda dosahuje vysoké citlivosti, přesnosti i robustnosti, což ji činí vhodnou pro rutinní kontrolu sialylace glykoproteinů.

Reference

• Varki A. Sialic acids in human health and disease. Trends Mol. Med. 2008, 14(8):351–360.
• Byrne B., Donohoe G.G., O’Kennedy R. Sialic Acids: Carbohydrate Moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical Proteins and Living Cells. Drug Discov. Today 2007, 12:319–326.
• Padler-Karavani V. et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans. Glycobiology 2008, 18:818–830.
• Thermo Fisher Scientific. Application Update 180: Direct Determination of Sialic Acids in Glycoprotein Hydrolyzates by HPAE-PAD. 2021.
• Thermo Scientific Dionex ICS-6000 Operator’s Manual, P/N 22181-97002, 2018.
• Thermo Scientific Electrochemical Detection User’s Compendium, P/N 065340-02, 2013.
• Thermo Scientific Dionex ICS-6000 Dual EGC Mode Installation, P/N 065760, 2020.
• Thermo Fisher Scientific Technical Note 41: Analysis of Sialic Acids Using HPAE. 2000.
• Thermo Scientific Dionex CarboPac PA20 Columns Product Manual, P/N 031884, 2018.
• Thermo Fisher Application Update 181: Rapid Screening of Sialic Acids in Glycoproteins by HPAE-PAD.
• Thermo Fisher Application Note 253: HPAE-PAD Determination of Infant Formula Sialic Acids.
• ICH Guideline Q2B, Validation of Analytical Procedures, 1996.