Analysis of the Low-Abundance Plasma Biomarker Klotho in Less than Four Hours

Význam tématu

Biomarker Klotho je klíčovou molekulou ve výzkumu stárnutí a renálních onemocnění, avšak jeho nízké koncentrace v plasmatických vzorcích kladou vysoké nároky na citlivost analytických metod. Imunoafinitní obohacení spojené s masovou spektrometrií nabízí řešení pro důkladnou a přesnou kvantifikaci tohoto proteinu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem byla demonstrace rychlé kvantifikace nízkonásobných hladin Klotho v plazmě pomocí LC-MS/MS využitím Thermo Scientific SMART Digest ImmunoAffinity kitu, který integruje imunoafinitní zachycení a tryptickou digesci v jediném kroku.

Použitá metodika a instrumentace

• Antibody pre-treatment: Biotinylace anti-Klotho protilátky pomocí NHS-biotinu.
• Vzorky: Myší plasma obohacená rekombinantním Klotho v rozsahu 1,58–500 ng/mL.
• Imunoafinitní obohacení: Inkubace vzorku s biotinylovanou protilátkou a SMART Digest IA Streptavidin ne-magnetickými perlemi po dobu 2 h při RT, následováno sedmi promývacími kroky.
• Digesce: Přímá aktivace trypsinu na perličkách při 70 °C a 1400 RPM po dobu 90 min.
• UHPLC: Thermo Dionex UltiMate 3000 RSLC s kolonkou Accucore C18 (2,1×50 mm, 2,6 µm), gradient 0,1 % FA v H₂O/ACN, průtok 0,5 mL/min, injekce 5 µL.
• MS/MS: Thermo Velos Pro Ion Trap v pozitivním režimu, nastavení kapiláry 375 °C, heater 350 °C, sheat gas 60, aux gas 20, spray voltage 4 kV.
• Zpracování dat: Thermo Chromeleon SR2 pro akvizici, Xcalibur pro kontrolu MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní hranice kvantifikace (LLOQ) 1,58 ng/mL v plazmě s opakovatelností CV 6,3 % pro peptid FSISWAR a 12,5 % pro LQDAYGGWANR bez použití izotopových standardů. Kalibrační křivky vykázaly vysokou linearitu (R²>0,97) napříč rozsahem 1,58–500 ng/mL. Celková doba přípravy vzorku se zkrátila na 3–4 hodiny oproti standardním protokolům trvajícím 15–24 hodin.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy díky integraci zachycení a digesce.
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost bez nutnosti redukce a alkylace.
• Kompatibilita s automatizovanými pracovními stanicemi a vysoký objem vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Strategie kombinující imunoafinitní obohacení a digesci lze rozšířit na multiplexní analýzy dalších nízkonásobných biomarkerů. Předpokládá se integrace plně automatizovaných workflow, vývoj specializovaných kitů pro různé typy vzorků a zlepšení termostability enzymů pro ještě rychlejší digesci.

Závěr

Popsaná metoda představuje rychlý, citlivý a vysoce reprodukovatelný přístup k kvantifikaci biomarkeru Klotho v plazmě. Díky jednorázovému imunoafinitnímu a digestačnímu kroku je dosaženo významného zkrácení času přípravy a zvýšení analytické výkonnosti.

Reference

1. Rodriguez T. Identifying significant biological markers in Klotho gene variants across wide ranging taxonomy. Journal of Molecular Biology Research. 2015;5(1):11.
2. Rotondi S, Pasquali M, Tartablione L et al. Soluble α-Klotho serum levels in chronic kidney disease. International Journal of Endocrinology. 2015;872193.
3. Massó A, Sánchez A, Gimenez-Llort L et al. Secreted and Transmembrane α-Klotho Isoforms have different spatiotemporal profiles in the brain during aging and Alzheimer’s disease progression. PLoS ONE. 2015;10(11):e0143623.
4. Lim K, Groen A, Molostvov G et al. α-Klotho expression in human tissues. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2015;100(10):e1308–1318.