Comparative Analysis of Agilent AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep

Význam tématu

Glykozylace patří mezi klíčové atributy kvality bioterapeutik, protože ovlivňuje stabilitu, biologickou aktivitu, imunitní reaktivitu i farmakokinetiku proteinu. Podrobná charakterizace N-vázaných glykánů je nezbytná pro zajištění konzistentní výroby monoklonálních protilátek (mAbs) a Fc-fúzních proteinů. Spolehlivé, rychlé a reprodukovatelné metody uvolňování, značení a analýzy glykánů jsou základními kontrolními body během vývoje a výroby biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává dvě komerční sady pro přípravu a analýzu N-glykánů: Agilent AdvanceBio Gly-X N-glycan prep s InstantPC (IPC) a Waters GlycoWorks RapiFluor-MS (RFMS). Oba systémy zahrnují moduly pro denaturaci/deglykozylaci, fluorescenční značení a čištění vzorku. Cílem je vyhodnotit:

• citlivost fluorescence (FLD) a hmotnostní spektrometrie (MS),
• rozdíly ve stabilitě reagenčních složek a flexibilitě workflow,
• účinnost detekce glykánů z různých bioterapeutik (MabThera, Enbrel, Orencia apod.),
• reprodukovatelnost a možnost škálování glykopreparace (2–100 µg proteinu).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky obsahující 15–40 µg (IPC) nebo 15 µg (RFMS) proteinu byly denaturovány, ošetřeny PNGase F, označeny buď IPC nebo RFMS barvivem a po SPE čištění analyzovány HILIC-LC/FLD/MS. Rozlišení zajišťovala kolona Agilent AdvanceBio Glycan Mapping (2.1 × 150 mm, 1.8 µm) za gradientu 80–40 % acetonitrilu v 50 mM amonném formiátu (pH 4.4).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II HPLC (pumpa, autosampler, multicolumn thermostat)
• Agilent 1260 Infinity II FLD (IPC λEx 285 nm/λEm 345 nm, RFMS λEx 265 nm/λEm 425 nm)
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF s AJS ESI zdrojem
• Split po FLD (~50 % do MS)

Hlavní výsledky a diskuse

Obě barviva poskytla kvalitní HILIC separaci s obdobným pořadím eluce, přičemž IPC glykany elují přibližně o 1 min rychleji než RFMS. Přestože při standardní bílkovinné hmotnosti 15 µg vykazovaly FLD signál sady RFMS a IPC srovnatelně, navýšení proteinu na 40 µg u IPC vedlo k 2–3× vyššímu fluorescenčnímu signálu. IPC barvivo také prokázalo mírně lepší ionizační účinnost v MS. Oba systémy umožnily rozlišení kritických glykanových párů (G0F vs. Man5, izomery G1F[6]/G1F[3], sialylované formy). IPC navíc převedlo standardně až 100 µg proteinu, RFMS pouze 15 µg.

Přínosy a praktické využití metody

• zjednodušené, rychlé (celkem ~1 h) end-to-end workflow,
• široký rozsah glykopreparace (2–100 µg proteinu) bez nutnosti měnit spotřebu reagenčních lahviček,
• vysoká reprodukovatelnost (%CV < 6 % pro hlavní glykany),
• možnost detekovat nízkomnožstevní glykany (sialylované, větvené).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj fluorescenčních a MS-aktivních značení pro vyšší citlivost a stabilitu, automatizace přípravy vzorku v high-throughput formátu a integrace glykomiky do multi-atributového monitoringu (MAM) bioterapeutik. Dále se předpokládá využití pokročilých MS technik (ion mobility, top-down glycoproteomika) a online coupling s bioprocesními kontrolami.

Závěr

Porovnání ukázalo, že oba kitové přístupy jsou vhodné pro rychlou a reprodukovatelnou analýzu N-glykánů bioterapeutik. AdvanceBio Gly-X s InstantPC nabízí širší flexibilitu množství vzorku, vyšší fluorescence a MS citlivost při vyšších hmotnostech proteinu a stabilnější reagenční sada, což usnadňuje workflow v rutině QC i výzkumu.

Reference

1. Delobel A. In Glycosylation of Therapeutic Proteins: A Critical Quality Attribute. In Mass Spectrometry of Glycoproteins: Methods and Protocols; Springer US, 2021; pp. 1–21.
2. Zhang X., et al. Routine Analysis of N-Glycans Using Liquid Chromatography Coupled to Routine Mass Detection. In Mass Spectrometry of Glycoproteins: Methods and Protocols; Springer US, 2021; pp. 205–219.
3. Keser T., et al. Comparison of 2-Aminobenzamide, Procainamide and RapiFluor-MS as Derivatizing Agents for High-Throughput HILIC-UPLC-FLR-MS N-Glycan Analysis. Front. Chem. 2018, 6, 324.