Extraction of Desmopressin from Serum Using EVOLUTE® EXPRESS WCX Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Desmopressin je syntetický analog vasopresinu využívaný v klinické praxi k léčbě močových poruch a poruch srážlivosti krve. Přesná kvantifikace tohoto peptidu v lidském séru je nezbytná pro monitorování terapie, zajištění kvality laboratorních výsledků a pro farmakokinetické studie. Vyčištěný a koncentrovaný vzorek minimalizuje interferenci proteinů, lipidů a fosfolipidů, což zvýší citlivost a spolehlivost LC-MS/MS analýzy.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje validaci rychlého a reprodukovatelného protokolu na extrakci desmopressinu ze séra za použití 96-vrstvých destiček EVOLUTE EXPRESS WCX před následnou analýzou LC-MS/MS. Hlavní cíle zahrnují dosažení vysoké návratnosti (>80 %), nízké mezní hodnoty kvantifikace (LOQ 0,2 ng/ml) a účinné odstranění rušivých látek.

Použitá instrumentace

• EVOLUTE EXPRESS WCX 96-well destička (30 mg, Biotage)
• Biotage SPE Dry 96 (vzorkový odpařovač)
• Biotage PRESSURE+ 96 manifold
• Waters ACQUITY I-Class UHPLC
• ACE EXCEL C18-amide kolona (1,7 μm, 100 × 2,1 mm)
• Xevo TQ-S triple quadrupole MS s ESI zdrojem
• Biotage kolekční destička a uzávěry

Použitá metodika

1. Příprava vzorku: 200 μl séra se naředilo 200 μl 10 mM amonium octanu pH 6.
2. SPE procedura:
   
   1. Podmínění: 1 ml methanolu
   2. Equilibrování: 1 ml 10 mM amonium octanu pH 6
   3. Naložení: 400 μl pripraveného séra
   4. První wash: 1 ml 10 mM amonium octanu pH 6
   5. Druhý wash: 1 ml methanolu
   6. Eluce analyzátu: 200 μl 2 % kyseliny mravenčí v metanolu/vodě (70/30 v/v)
3. Post-eluce: Odpaření eluátu při 40 °C a opětovná resekvestrace do 200 μl 0,1 % kyseliny mravenčí v H2O/MeCN (50/50 v/v).
4. UHPLC podmínky:
   
   • Mobilní fáze A: 0,1 % HCOOH ve vodě, B: 0,1 % HCOOH v acetonitrilu
   • Gradient: 0–4 min z 90/10 na 5/95, 4–5 min udržení, 5–5,5 min návrat na 90/10
   • Průtok: 0,3 ml/min, injekce 2 μl, teplota kolony 40 °C, vzorek při 20 °C
5. MS podmínky:
   
   • Pozitivní ionizace, desolvace 500 °C, zdroj 150 °C
   • MRM přechody: 535,3→328,2 (quant), 535,3→120,1 (qual); cone 30 V, kolizní energie 25/20 eV

Hlavní výsledky a diskuse

• Dosaženy recovery >80 % s homogenním RSD <10 % v rozmezí 0,2–200 ng/ml.
• Lineární kalibrační křivky v sérovém matrice (r² >0,99), LOQ 0,2 ng/ml.
• Chromatogramy ze séra se 5 ng/ml desmopressinu vykázaly ostré, symetrické píky.
• Analýza fosfolipidů prokázala účinné odstranění rušivých složek ve srovnání s jednoduchou precipitací proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká míra automatizace a throughput v 96-well formátu.
• Výrazné snížení matričních interferencí, zejména fosfolipidů a proteinů.
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost vhodná pro vysoce kvalitní klinické a farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace do plně automatizovaných pracovních postupů.
• Rozšíření aplikace na další peptidové hormony a biologické markery.
• Použití ve spojení s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro strukturální analýzu.
• Vývoj multi-analyzátorových metod pro současnou detekci více peptidů.

Závěr

Protokol SPE pomocí EVOLUTE EXPRESS WCX destabilizuje matrici lidského séra, poskytuje vysoké recovery desmopressinu a čisté extrakty vhodné pro LC-MS/MS analýzu. Metoda je robustní, vysoce citlivá a připravená pro klinické a výzkumné nasazení.

Reference

• Biotage Application Note AN887, 2017, Extrakce desmopressinu ze séra pomocí EVOLUTE EXPRESS WCX před LC-MS/MS analýzou.