Extraction of Barbiturates from Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to GC/MS Analysis

Význam tématu

Analýza barbiturátů v plné krvi je zásadní pro toxikologické vyšetření, klinické monitorování i forenzní aplikace. Přesné stanovení těchto sedativních látek přispívá k bezpečnosti pacientů, prevenci zneužívání a podpoře rozhodování v soudní praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo ověřit použití sorpčních SLE+ sloupců pro extrakci sedmi barbiturátů z plné krve před kapalinovou chromatografií spojenou s hmotnostní detekcí (GC/MS). Představený protokol zároveň umožňuje současné stanovení látek z jiných tříd drog (amphetaminy, benzodiazepiny, kokain, opiáty).

Použitá metodika a instrumentace

Schéma přípravy vzorku:

• Do 1 ml plné krve se přidá 10 μl interní standardu (100 ng/ml), následuje úprava alkalinitou 1% roztokem amoniaku.
• Na SLE+ kolonu (1 ml kapacita) se aplikuje 750 μl připravené matrice, vzorek se nechá absorbovat.
• Extrahce probíhá dvěma 2,5 ml porcemi dichlormetanu (alternativně MTBE), každá ponechána 5 minut samospádem a poté vytažena pod mírným vakuem.
• Výtěr se koncentruje proudem vzduchu nebo dusíku při 40 °C, následně se vzorek rekonstituuje v 250 μl ethylacetátu a po krátkém promíchání se do 80 μl přidá 20 μl roztoku trimethylaniliniového hydroxidu.

Instrumentace GC/MS:

• GC: Agilent 7890A se sloupcem DB-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm), nosný plyn helium 1,2 ml/min, injektor splitless 150 °C.
• Program pece: 120 °C po 1 min, nárůst 12 °C/min do 192 °C, poté 100 °C/min do 330 °C s jednostupňovým zpětným proplachem.
• MS: Agilent 5975C, zdroj 230 °C, kvadrupól 150 °C, provoz v režimu SIM, stanovení kvantitativních a kvalitativních iontů pro každou látku.

Hlavní výsledky a diskuse

Výtěžnost extrakce při 100 ng/ml byla u všech barbiturátů reprodukovatelná, s relativními standardními odchylkami pod 10 %. Použití dichlormetanu i MTBE poskytlo srovnatelné výsledky, avšak pro simultánní extrakci kokainu a jeho metabolitů je doporučeno dichlormethan. Kalibrační křivky ve spektru 10–500 ng/ml vykázaly koeficient determinace mezi 0,9983 a 0,9990. Limit kvantifikace (LLOQ) se pohybuje typicky mezi 20 a 100 ng/ml dle barbiturátu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda eliminuje nutnost precipitace proteinů a riziko emulzí spojených s klasickou LLE. SLE+ sloupce umožňují rychlou a čistou extrakci s vysokou reprodukovatelností. Doporučený protokol podporuje simultánní stanovení více tříd drog, což snižuje čas a spotřebu reagencií ve výzkumných a kontrolních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace tabless (bez příruby) SLE+ kolonek v automatických platformách pro zvýšení throughput.
• Uplatnění nechlorovaných rozpouštědel (MTBE) pro ekologičtější postupy a rozšíření na další analyty.
• Adaptace protokolu na bioanalytické metody LC-MS/MS a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii pro širší spektrum detekovaných látek.

Závěr

Prokázané použití ISOLUTE SLE+ sloupců umožňuje spolehlivou extrakci barbiturátů z plné krve s minimální manipulací, vysokými výtěžnostmi a nízkými LLOQ. Metoda nabízí efektivní alternativu k tradičním LLE postupům, podporuje multiplexní analýzu a zkracuje dobu přípravy vzorků.