Extraction of Tetrahydrocannabinol (THC) and Metabolites from Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC-MS/MS

Význam tématu

Detekce a kvantifikace Δ9-tetrahydrokanabinolu (THC) a jeho hlavních metabolitů v celém krevním vzorku je klíčová pro forenzní a klinickou toxikologii. Krev představuje jednu z nejnáročnějších matric z důvodu viskozity, vysokého obsahu buněk a endotoxických interferencí, které mohou negativně ovlivnit citlivost a přesnost LC-MS/MS metod. Efektivní příprava vzorku je proto zásadní pro minimalizaci iontového potlačení a dosažení reprodukovatelných výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ověřit schopnost podpůrné kapalinné extrakce (Supported Liquid Extraction, SLE+) pomocí sorbentu ISOLUTE® SLE+ v 96-buněčném formátu pro izolaci THC a čtyř hlavních metabolitů (THC-COOH, THC-OH a jejich deuterovaných derivátů) z antihumanního i postmortem celého krve. Studie porovnává rychlost, výtěžnost a čistotu eluovaných analytů s klasickými technikami LLE a SPE.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Odběr 200 µl kreve promíchané s vnitřními standardy (deuterované analogické sloučeniny).
• Přidání 100 µl 0,1 % kyseliny mravenčí pro zlepšení seskupení proteinů.
• Načeření vzorku na sorbentu ISOLUTE® SLE+ (400 µl kapacita), krátké vakuové zatížení, 5min absorpce.
• Eluce analyzů třemi 600 µl dávkami methyl-tert-butyl etheru (MTBE), gravitace + mírné vakuum/pozitivní tlak.
• Odpaření eluátu a rekonstrukce v 500 µl směsi voda : metanol (50 : 50, v/v).

HPLC-MS/MS podmínky:

• Chromatografie: Agilent 1200, kolona Phenomenex Gemini C18 (150×4,6 mm, 5 µm), isokratická eluční fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí/voda a B: metanol s 0,1 % kyselinou mravenčí (5 % A : 95 % B, 5 min).
• MS/MS: Sciex 4000 Q-Trap, ESI+ Turbo Ionspray, teplota zdroje 700 °C, MRM přechody pro každý analyt (viz tab. 1 v originále), deklusterační potenciál 30 V, kolizní střední energie 23–28 V, CXP 16 V.

Použitá instrumentace

• ISOLUTE® SLE+ 400 µl Supported Liquid Extraction Plate (Biotage 820-0400-P01).
• VacMaster-96 Sample Processing Manifold / PRESSURE+ 96 Positive Pressure Manifold pro aplikaci vakua nebo tlaku.
• Agilent 1200 HPLC systém.
• Applied Biosystems/MDS Sciex 4000 Q-Trap triple quadrupole s Turbo Ionspray.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve studii byly dosaženy průměrné výtěžnosti od 60 do 107 % pro koncentrace 12,5–50 ng/ml s opakovatelností (RSD) pod 10 %. Iontové potlačení vyvolané matricí bylo menší než 10 %, což potvrzuje schopnost SLE+ odstranit většinu endogenních interferencí. Extrahované iontové chromatogramy pro 25 ng/ml vzorky prokázaly ostré a symetrické píky bez významných pozadí.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: celý proces přípravy vzorku v 96-well formátu je dokončen během 30–40 min.
• Vyšší čistota: minimální iontové potlačení díky efektivní separaci lipofilních analytů od proteinových a buněčných složek.
• Jednoduchost: eliminace opakovaných přenosů vzorku a kompatibilita s automatizovanými platformami.
• Reprodukovatelnost: nízké RSD včetně deuterovaných interních standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Podporované kapalinné extrakce typu SLE+ se mohou dále rozvíjet po stránce:

• Miniaturizace sorbentů pro microeluce a úsporu rozpouštědel.
• Integrace s online HPLC-MS/MS vzorkovači pro plně automatizované workflow.
• Rozšíření na jiné biologické matrice (moči, sliny, tkáně) a nové třídy drog.
• Využití zelených rozpouštědel a udržitelných sorbentů s nízkým ekologickým dopadem.

Závěr

Použití ISOLUTE® SLE+ v 96-well formátu poskytuje rychlou, reprodukovatelnou a čistou extrakci THC a jeho metabolitů z celého krevního vzorku. Výtěžnosti nad 60 %, nízké iontové potlačení a kompatibilita s LC-MS/MS potvrzují vhodnost metody pro forenzní a klinickou toxikologii. Metoda nabízí výrazné časové a materiálové úspory oproti tradičním LLE a SPE postupům a je připravena k dalšímu rozvoji v automatizaci a rozšíření spektra analyzovaných látek.

Reference

Pracovní standardy THC a metabolitů: Cerilliant Corp.
ISOLUTE® SLE+ sorbent: Biotage AB
Chromatografický a hmotnostní analyzátor: Agilent Technologies, Applied Biosystems/MDS Sciex