Multi Dimensional HPLC Separation of Monoclonal Antibody Mixtures from Cell Culture Supernatants

Význam tématu

Charakterizace terapeutických monoklonálních protilátek (mAbs) vyžaduje komplexní přístup k analýze jejich strukturních a posttranslačních variací. Kombinovaná dvourozměrná kapalinová chromatografie (2D-LC) spojená s hmotnostní spektrometrií (MS) umožňuje provést multiatributovou analýzu (MAA) v jediném automatizovaném běhu. Tato metoda zkracuje čas přípravy vzorků, minimalizuje lidský zásah a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků v oblasti biopharma výzkumu a kontroly kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované aplikace je demonstrovat automatizované 2D-LC/MS řešení schopné současně stanovit:

• titer mAb přímo z buněčných kultivačních supernatantů,
• velikostní, náboje a hydrofóbní varianty protilátek (SEC, CEX, HIC),
• molekulovou hmotnost, aminokyselinovou sekvenci a post-translační modifikace (např. glykozylace, deamidace, oxidace, fragmentace, agregace).

Automatický systém umožňuje plynulý přechod mezi dimenzemi bez ztráty rozlišení a zajišťuje rychlou výměnu metod.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje tři hlavní kroky:

• První dimenze – Protein A afinitní chromatografie k izolaci mAb z buněčného supernatantu.
• Srdeční řezy („heart‐cuts“) a přesměrování do druhé dimenze, kde probíhá více metod podle zvoleného atributu:
• Size-Exclusion Chromatography (SEC) pro stanovení velikostních variant a odsolení před MS.
• Cation-Exchange Chromatography (CEX) pro identifikaci nabíjených variant.
• Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) pro rozlišení hydrofóbních variant.
• Hmotnostní spektrometrie (3D, SEC-MS) pro detailní analýzu molekulové hmotnosti a post-translačních modifikací.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC systém s automatizovanou srdeční řezací jednotkou.
• Agilent 6545 Q-TOF nebo obdobný MS detektor pro vyčerpávající rozlišení hmotnosti.
• Kolony: Bio-Monolith Protein A, AdvanceBio SEC 300 Å, Bio MAb NP5 PK (SEC-MS), AdvanceBio HIC.
• Přístroje pro přípravu vzorků: PES stříkačkové filtry, deaktivované skleněné a PP lahvičky, ultrarez čisté rozpouštědla a pufry.

Hlavní výsledky a diskuse

Ukázalo se, že systém dokáže:

• Odlišit hlavní vrcholy a varianty mAb z různých klonů (např. originátor vs. CHO klon 10) v 1D Protein A chromatogramu.
• Selektivně separovat velikostní a nábojové varianty v druhé dimenzi s vysokým rozlišením.
• Detailně profilovat glykanové struktury (G0F/G1F/G2F ad.) pomocí SEC-MS dekonvoluce.

Automatizace přepínání mezi jednotlivými druhými dimenzemi neovlivnila kvalitu separace ani citlivost MS.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou analýzu kvality a čistoty protilátek v procesu vývoje i QA/QC.
• Úsporu času díky plné automatizaci 2D-LC/MS workflow bez nutnosti manuálních zásahů mezi metodami.
• Kvalitativní i kvantitativní informace o čistotě, titeru, variantách a modifikacích v jednom experimentu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace pokročilých modulů pro vícedimenzionální chromatografii (3D-LC) s kompatibilitou dalších typů separací.
• Real-time datová analýza a umělá inteligence pro automatické vyhodnocení multiatributových profilů.
• Další miniaturizace a škálovatelnost pro vysokoprodukční screening mAb a biosimilars.

Závěr

Automatizované 2D-LC/MS řešení s Protein A afinitou a multimodální druhou dimenzí (SEC, CEX, HIC) představuje robustní a efektivní přístup k multiatributové charakterizaci mAb. Díky propojení chromatografie a hmotnostní spektrometrie umožňuje komplexní profilování struktury a post-translačních modifikací v jediném běhu, což významně zkracuje dobu analýz a zvyšuje kvalitu dat.

Reference

1. Carr P.W., Stoll D.R. Two-Dimensional Liquid Chromatography Principles, Practical Implementation and Applications, Agilent application note 5991-2359EN.
2. Determination of Multiple Attributes of Monoclonal Antibodies, application note 5994-3521EN.
3. Automated Monoclonal Antibody Subunit Analysis by Online Reduction Using 2D-LC/MS, application note 5994-4309EN.
4. Multiple Heart-Cutting 2D-LC Analysis of Innovator versus Biosimilar Monoclonal Antibodies, application note 5991-6673EN.
5. mAb Titer Determination in 60 Seconds Using the Agilent Bio-Monolith Protein A Column, application note 5994-3969EN.
6. Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution user guide, G2198-90001.
7. Agilent Heart-cutting 2D-LC Software Tutorial.
8. Agilent Bio-Monolith Protein A and G Columns Data Sheet, 5991-6040EN.