Size and Purity Assessment of Single-Guide RNAs by Anion-Exchange Chromatography (AEX)

Význam tématu

CRISPR/Cas9 technologie využívá single-guide RNA jako klíčovou součást v genové editaci. Kvalitativní i kvantitativní určení délky a čistoty sgRNA zajišťuje spolehlivé výsledky v laboratorní praxi a při výrobě léčivých přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na:

• odhad velikosti sgRNA (100–150 nukleotidů) porovnáním s Low Range ssRNA Ladder (50–500 nt)
• posouzení čistoty sgRNA ve stejné chromatografické analýze
• optimalizaci aniontové výměnné chromatografie na kolóně Waters Protein-Pak Hi Res Q

Použitá metodika a instrumentace

Aniontová výměnná chromatografie (AEX) separuje RNA podle jejich záporného náboje na fosfátovém řetězci. Pro úpravu pH a iontové síly byly použity Tris pufry a TMAC.

• LC systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Kolona: Protein-Pak Hi Res Q, 5 µm, 4.6 × 100 mm
• Detekce: UPLC TUV detektor při 260 nm
• Teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 10 °C
• Mobilní fáze: 100 mM Tris-HCl, 100 mM Tris base, 3 M TMAC, voda
• Gradient: pH 9.0, lineární nárůst soli 0–2400 mM TMAC

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky (pH 9.0, 60 °C, TMAC) umožnily rozdělení Low Range ssRNA Ladder a pěti ssRNA vzorků s ostrými špičkami podobně jako na agarózovém gelu. Kalibrační křivka retenčního času vs. logaritmus délky RNA dosáhla korelace R2 = 0.993. Chyba odhadu délky byla menší než 6 %. Nižší teplota kolony (30 °C) nebo použití NaCl vedly k vícenásobným špičkám, pravděpodobně izomerům RNA. Čistota hrubého a purifikovaného HPRT sgRNA byla stanovena na 37.4 % respektive 88.0 %.

Přínosy a praktické využití metody

• robustní a reprodukovatelná separace
• kvantitativní určení velikosti a čistoty ve stejném běhu
• nízká spotřeba vzorku a snadná automatizace
• vhodné pro QA/QC procesy v biotechnologii a výrobě RNA

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit na analýzu ssRNA v celém rozsahu 50–500 nt, včetně modifikovaných RNA. Integrace s automatickým sběrem frakcí a vyšší průchodnost analýz podpoří výzkum a vývoj nových gene editing nástrojů.

Závěr

Aniontová výměnná chromatografie na kolóně Waters Protein-Pak Hi Res Q prokázala vysokou přesnost při určování délky a čistoty sgRNA. Tento postup nabízí rychlou, přesnou a jednoduše automatizovatelnou alternativu k tradičním metodám.

Reference

1. Dunbar C E et al. Science 2018;359:175
2. Rath D et al. Biochimie 2015;117:119–128
3. Hsu P D et al. Cell 2014;157:1262–1278
4. Yang H; Koza S; Chen W. Waters App Note 2020;720006825
5. Yang H; Koza S; Chen W. Waters App Note 2021;720007207
6. Yang H; Koza S; Chen W. Waters App Note 2021;720007321