Application Note 20709 SPE-LC-MS/MS Method for the Determination of Nicotine, Cotinine, and Trans-3-hydroxycotinine in Urine

Význam tématu

Metabolity nikotinu jsou klíčovými markery expozice tabákovému kouři a jejich kvantifikace v moči je zásadní pro klinické studie, toxikologii a hodnocení nefarmakologické expozice.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení nikotinu, kotininu a trans-3-hydroxykotininu v lidské moči pomocí SPE-LC-MS/MS s krátkým cyklem analýzy.

Použitá metodika

Vzorky moči byly předběžně ošetřeny přidáním vnitřního standardu (cotinin-d3) a úpravou pH. Následovala pevná fáze extrakce na cartridge SOLA CX, která zahrnovala kondicionaci, aplikaci vzorku, dvojí fázi mytí a eluci. Po usušení pod dusíkem se eluáty rekonstituovaly v 200 µl vody/methanolu (70:30 v/v). Separace proběhla gradientním elucí na kolonce Syncronis C18 1.7 µm (50 × 2.1 mm) při 0,2 ml/min a 30 °C.

Použitá instrumentace

Separační část:

• UHPLC Thermo Scientific Accela 600
• Kolonka Syncronis C18 1.7 µm, 50 × 2.1 mm se strážnou kolonkou

MS detekce:

• Thermo Scientific TSQ Vantage
• HESI pozitivní ionizace, spray 3500 V, vaporizér 400 °C, S-lens dle analyzovaného iontu
• SRM přechody: nikotin m/z 163.1→130.1, kotinin 177.1→80.1, trans-3-hydroxykotinin 193.1→80.1

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární rozsah 1–1000 ng/ml pro nikotin a kotinin a 10–1000 ng/ml pro trans-3-hydroxykotinin s koeficienty determinace >0,999. LLOQ dosahovalo 1 ng/ml (nikotin, kotinin) a 10 ng/ml (trans-3-hydroxykotinin). Přesnost (střední relativní chyba) byla v mezích ±15 % (±20 % u LLOQ) a opakovatelnost (RSD) <9 %. Průměrné zotavení analyzátů z matice přesahovalo 79 %.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá doba analýzy (3 minuty), nízká spotřeba rozpouštědel, vysoká propustnost a robustnost extrakce z komplexní matrice umožňují aplikaci v bioanalytických, klinických a toxikologických laboratořích pro monitoring expozice nikotinu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat automatizaci přípravy vzorků a online SPE, rozšíření panelu analyzovaných metabolit, využití vysokorozlišovací MS pro screening, miniaturizaci analytických systémů a implementaci principů zelené chemie ke snížení spotřeby rozpouštědel.

Závěr

Navržená SPE-LC-MS/MS metoda nabízí spolehlivou a citlivou kvantifikaci nikotinu a jeho klíčových metabolitů v moči s vysokou přesností, opakovatelností a efektivitou vhodnou pro rutinní i výzkumné aplikace.