SPE and LC-MS/MS Method for the Determination of 25-Hydroxyvitamin D2 and 25-Hydroxyvitamin D3 from Human Plasma

Význam tématu

Vitamin D je klíčový hormon regulující metabolismus vápníku a fosforu, jehož nedostatek se váže na osteoporózu u dospělých a křivici u dětí. Měření 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 (25-OHD2, 25-OHD3) představuje standardní biomarker celkového zásobení organismu vitaminem D díky vyšším koncentracím v krvi a delší poločasu ve srovnání s aktivní formou.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout rychlou, citlivou a reprodukovatelnou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci 25-OHD2 a 25-OHD3 v lidské plazmě. Metoda kombinuje hydrophobic reversed phase SPE s APCI ionizačním zdrojem a UHPLC separaci na krátké kolonce Syncronis C18, umožňující čas běhu 2 minuty.

Použitá metodika

Sample preparation je založena na proteinové precipitaci acetonitrilem (poměr 1:1) a následném SPE na destičce SOLA HRP. Vzorky se načítají, operují se praním 60:40 voda/methanol a eluují 100 % methanolem. Suchý extrakt se rekonstituuje ve směsi voda/acetonitril (30:70 v/v).

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000
• Kolonka Syncronis C18, 1.7 µm, 50 × 2.1 mm
• Mobilní fáze: A – voda + 0.1 % kyselina mravenčí; B – acetonitril + 0.1 % kyselina mravenčí; gradient 70–100 % B za 2 min
• MS přístroj Thermo Scientific TSQ Vantage, APCI pozitivní ionizace
• MRM přechody: 25-OHD2 395.4→269.2/209.2; 25-OHD3 383.3→211.2/365.4; IS D6-25-OHD3 389.3→371.4

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah metody pokrývá koncentrace 5–1000 ng/mL s koeficienty regresí r2 = 0.9994 (D2) a 0.9958 (D3). Limitem kvantifikace byla hodnota 5 ng/mL pro obě formy. Recoveries dosahovaly průměrně 94.4 % (25-OHD2) a 96.3 % (25-OHD3). Precision (%RSD, n=6) byla <4.2 % pro všechny QC hladiny (15, 250, 600 ng/mL).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou přípravu vzorku, vysokou čistotu extraktu a nízkou spotřebu vzorku i rozpouštědel, což umožňuje vysokoprůchodní analýzy v klinických a bioanalytických laboratořích. Krátký čas běhu 2 minuty zvyšuje kapacitu laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření panelu vitamínů a jejich metabolitů v jedné analýze
• Automatizace přípravy a přímá analýza krevních vzorků
• Integrace s vysokorozlišovacími hmotovými spektrometry pro širší identifikaci biochemických markerů
• Nasazení metody v personalizované medicíně a populačních studiích

Závěr

Implementace SOLA HRP SPE a rychlé UHPLC-MS/MS analýzy umožnila spolehlivou kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě. Metoda splňuje požadavky na citlivost, linearitu, přesnost a reprodukovatelnost, což ji předurčuje pro rutinní klinické a výzkumné aplikace.

Reference

1. Holick MF et al. Endocrine Society clinical practice guideline. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011;96(7):1911–1930.
2. Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D. National Academy Press, 2010.