SPE and LC-MS/MS method for the determination of 25-Hydroxyvitamin D2 and 25-Hydroxyvitamin D3 from human plasma

Význam tématu

Monitorování koncentrací metabolitů vitaminu D v plazmě je klíčové pro diagnostiku nedostatku a hodnocení rizika kostních onemocnění. 25-hydroxyvitamin D2 a D3 jsou stabilní formy s dostatečně vysokými sérovými hladinami, které umožňují přesné vyhodnocení stavu vitaminu D u pacientů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, reprodukovatelnou a citlivou metodu pro simultánní stanovení 25-OHD2 a D3 z lidské plazmy. Autoři navrhli vzorky zpracovat pomocí moderního SPE produktu SOLA HRP a separaci provést na UHPLC sloupci Syncronis C18 s krátkým analytickým cyklem 2 minuty při zachování ostrých chromatografických vrcholů.

Použitá instrumentace

• Pevnofázová extrakční deska SOLA HRP (Thermo Scientific)
• HPLC systém Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific)
• UHPLC kolona Syncronis C18, 1.7 µm, 50×2.1 mm
• TSQ Vantage triple quadrupole s APCI zdrojem (Thermo Scientific)
• Software LCQUAN verze 2.6 (Thermo Scientific)
• Pomůcky pro manipulaci se vzorky: vakuová deska a UltraVap sušička

Použitá metodika

Příprava vzorku začínala denaturací vazby na proteiny přidáním acetonitrilu v poměru vzorek:rozpouštědlo max. 1:1. Po centrifugaci se supernatant aplikoval na SPE desku SOLA HRP, která byla předtím kondicionována MeOH a vodou. Promytí proběhlo 40 % MeOH a eluční frakci získali autoři na 100 % MeOH. Po vysušení pod dusíkem byl extrakt rekonstituován v roztoku 30:70 voda:acetonitril.
Separace byla realizována gradientem z 70 % na 100 % acetonitrilu s 0,1 % kyselinou mravenčí během 2 minut při průtoku 0,8 mL/min a teplotě kolony 40 °C; objem injekce činil 50 µL.
MS detekce používala pozitivní APCI, sledovaly se přechody m/z 395.4→209.2, 269.2 pro D2; 383.3→211.2, 365.4 pro D3; 389.3→371.4 pro interní standard D6-D3.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla kvantifikačního limitu 5 ng/mL pro oba analyty a lineárního rozsahu 5–1000 ng/mL s koeficienty r2 0,9994 (D2) a 0,9958 (D3). Preciznost (RSD) byla nižší než 4,2 % pro všechny úrovně QC. Průměrná návratnost činila 94,4 % pro 25-OHD2 a 96,3 % pro 25-OHD3. Díky vysoké retenci na kolóně se analyty dobře oddělily od isobarických interferencí.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava a krátký analytický cyklus
• Snížené požadavky na objem vzorku i rozpouštědla
• Vysoká čistota extraktů a reprodukovatelnost výsledků
• Vhodné pro klinickou diagnostiku a rutinní QC v bioanalytických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další metabolity vitaminu D a začlenit do multiplexních bioanalytických panelů. Perspektivní jsou větší automatizace přípravy vzorků, miniaturizace SPE formátů a vývoj citlivějších detekčních technik pro sledování i ultra-sledovaných forem vitaminu D.

Závěr

Navržená metoda kombinuje efektivní SPE extrakci a rychlou UHPLC-MS/MS analýzu, poskytuje spolehlivé stanovení 25-OHD2 a D3 z lidské plazmy s vysokou reprodukovatelností, citlivostí a provozní efektivitou.

Reference

• Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA et al. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(7):1911–1930.
• Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D. National Academy Press; 2010.