SEC-MS with Volatile Buffers for Characterization of Biopharmaceuticals

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) představuje základní techniku separace biofarmaceutik na základě velikosti molekuly. Díky šetrnému režimu při pokojové teplotě a možnosti přímého stanovení molární hmotnosti pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) nachází SEC uplatnění v kvalitativní i kvantitativní kontrole monoklonálních protilátek, proteinových agregátů a dalších komplexních biologických přípravků.

Cíle a přehled studie

• Ověřit vhodnost biokompatibilního UHPLC systému Vanquish Flex pro SEC separace s volatilitními pufry kompatibilními s MS.
• Porovnat denaturovanou SEC s přímým přípojením na Orbitrap MS pro stanovení molekulových hmotností a rozlišení proteinových štěpení.
• Ukázat možnosti optimalizace koncentrace TFA pro minimalizaci sekundárních interakcí při zachování citlivosti MS detekce.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona Thermo Scientific MAbPac SEC-1, póry 300 Å, velikost částic 5 µm, rozměr 4 × 300 mm.
• Mobilní fáze izokratická: 0,1 % kyseliny mravenčí, 0,05 % TFA v 30/70 acetonitril/voda, průtok 0,2 mL/min, teplota 25 °C, injekce 1 µL, detekce UV při 214 nm.
• UHPLC systém Vanquish Flex: System Base, Quaternary Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H, Diode Array Detector HL s LightPipe 10 mm.
• MS detekce na Q Exactive HF Orbitrap: zdroj HESI-II, capilární teplota 250 °C, rozmezí 1500–5000 a 400–3000 m/z, rozlišení 15 000/240 000, cílová hodnota 3e6, maximální doba injekce 200 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza směsi standardních proteinů (cytochrom c, myoglobin, ribonukleáza A, transferin) prokázala vysoce reprodukovatelné retenční objemy i vynikající hmotnostní přesnost dekonvoluovaných spekter (odchylka 0,75–1,23 ppm). Optimální koncentrace TFA (0,05–0,1 %) minimalizuje tvorbu proteinových komplexů a zajišťuje vysokou citlivost MS detekce. U modelu monoklonální protilátky (rituximab) bylo dosaženo zřetelného oddělení intaktní molekuly od redukovaných lehkého a těžkého řetězce se zdržením 0,7 min mezi pásy.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé stanovení molekulové hmotnosti proteinů bez nutnosti složité přípravy vzorku.
• Snížení sekundárních interakcí oproti iontovým párům v reverzní fázi.
• Schopnost desaltovat vzorek během separace a připravit ho pro MS analýzu.
• Rychlé izokratické separace bez časově náročného vyrovnávání.
• Uplatnění v QC laboratorních pracovištích i při vývojových studiích bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití SEC-MS k detailnímu sledování glykanačních vzorců, agregací a degradace biopolymerů. Quaternární pumpy nabízejí prostor pro screening mobilních fází a modulární biokompatibilní systémy povolují vysokoprůtokové i automatizované platformy. Integrace s novými typy kolon a vylepšenými detektory slibuje zkrácení analýz a zvýšení citlivosti pro substanční charakterizaci komplexních proteinových léků.

Závěr

Spojení biokompatibilního UHPLC systému Vanquish Flex se SEC separacemi v přítomnosti volatilitních kyselin (TFA, FA) a přímé připojení na Q Exactive HF Orbitrap MS tvoří efektivní, citlivou a flexibilní platformu pro komplexní charakterizaci biopharmaceutik. Metoda nabízí rychlé separace, vynikající hmotnostní přesnost i možnost detailního rozlišení proteinových struktur.

Reference

• Thermo Scientific Application Note 591: LC/MS Analysis of the Monoclonal Antibody Rituximab Using the Q Exactive Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer. 2013.
• Arakawa T., et al. The critical role of mobile phase composition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals. J Pharm Sci, 2010, 99(4), 1674–1692.