Comparing biosimilars using intact mass analysis under denaturing and native conditions

Význam tématu

Analýza intact hmotnosti monoklonálních protilátek umožňuje detailní posouzení proteoform v bioterapeutikách, včetně biosimilars. Sledování rozdílů v glykozylaci, odstraňování C-terminálních lyzinů a dalších PTM je zásadní pro zajištění kvality a bezpečnosti biopharma produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnání originátoru infliximabu, komerčního biosimiláru a interně připraveného biosimiláru pomocí rychlé intact mass analýzy za denaturačních a nativních podmínek. Dále se ukázat snadná optimalizace, rychlost a reprodukovatelnost metod na jednom hmotnostním spektrometru.

Použitá metodika a instrumentace

Pro denaturační intact mass analýzu byla využita reverzní fáze na kolóně MAbPac RP s eluenty kompatibilními s MS. Pro nativní analýzu se použila kolonka SEC MAbPac SEC-1 s 50 mM acetátovým pufrem. Oddělovací systém Vanquish Flex Binary UHPLC v kombinaci s Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotovým spektrometrem vybaveným BioPharma Option umožnil získat vysoké rozlišení v rozsahu m/z 1 500–8 000. Data byla zpracována v softwaru BioPharma Finder 3.0 pomocí ReSpect algoritmu.

Hlavní výsledky a diskuse

Intact mass analýza prokázala, že originátor (DP1) vykazoval převahu fukosylovaných a galaktosylovaných glykovariant s jedním či dvěma C-terminálními lyziny. Komerční biosimilár (DP2) měl vyšší míru odštěpení lyzinů a poněkud odlišný profil galaktosylace a nízkomannózových glykánů, což může ovlivnit biologickou aktivitu a clearance. Interní biosimilár vykázal výrazné truncace až 90 % a zvýšené množství afukosylovaných a vysokomannózových forem. Srovnání denaturační a nativní analýzy potvrdilo konzistentní výsledky, s jemnými rozdíly v relativní intenzitě některých proteoform.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá intact mass analýza bez rozsáhlé předúpravy minimalizuje artefakty vznikající při štěpení nebo derivatizaci.
• Komplexní charakterizace N-glykánového profilu a C-terminálních variant usnadňuje kontrolu kvality biosimilár.
• Jednoinstrumentální workflow (UHPLC-Orbitrap) šetří čas a zdroje ve vývoji a výrobě bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj nativní MS se zaměřením na větší proteiny a vícenásobné PTM otevře cestu k hlubší strukturní charak­terizaci. Integrace on-line separací (ion exchange, capillary electrophoresis) a rozšířená automatizace zrychlí QC procesy v bioprodukci. Kombinace intact analýzy s kolizními technikami (HDX-MS) nabídne informace o dynamice a interakcích mAb.

Závěr

Platforma Vanquish Flex UHPLC společně s Q Exactive Plus MS s BioPharma Option a BioPharma Finder softwarem poskytuje spolehlivou, rychlou a reprodukovatelnou intact mass analýzu monoklonálních protilátek za denaturačních i nativních podmínek. Metoda je ideální pro kontrolu kvality a porovnání originátorů a biosimilár.

Reference

1. Pisupati K. et al. A Multidimensional Analytical Comparison of Remicade and the Biosimilar Remsima. Analytical Chemistry, 2017, 89(9):4838–4846.
2. Lee C. et al. Glycosylation profile and biological activity of Remicade® compared with Flixabi® and Remsima®. mAbs, 2017, 9(5):968–977.
3. Tassi M. et al. Advances in native high-performance liquid chromatography and intact mass spectrometry for the characterization of biopharmaceutical products. Journal of Separation Science, 2018, 41(1):125–144.
4. Millán Martín S. et al. Comparability study for the determination of post-translational modifications of infliximab innovator and biosimilars by automated high-throughput peptide mapping analysis. Thermo Scientific Application Note 21849, 2018.
5. Raju T. S., Jordan R. E. Galactosylation variations in marketed therapeutic antibodies. mAbs, 2012, 4(3):385–391.
6. Bowden T. A. et al. Chemical and Structural Analysis of an Antibody Folding Intermediate Trapped during Glycan Biosynthesis. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(44):17554–17563.
7. Celltrion. CT-P13 (infliximab biosimilar). Briefing Document for the Arthritis Advisory Committee, FDA, 2016.