Quantification of free metanephrines in human plasma by LC-HRAM mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Analýza volných metanefrinů v lidské plazmě je klíčová pro diagnostiku vzácných nádorů nadledvin (pheochromocytom) a mimonadledvinových paragangliomů. Měření metanefrinu, normetanefrinu a 3-methoxytyraminu přispívá k přesnému určení zvýšené sekrece katecholaminů a tím k časnému odhalení onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují validovanou metodu kvantifikace plazmatických volných metanefrinů pomocí vysokorozlišovací LC-HRAM MS (Thermo Q Exactive Plus). Metoda kombinuje jednoduchou off-line SPE extrakci s přímou injekcí na Vanquish Flex Duo UHPLC a vyhodnocení v režimu Full Scan ddMS2 pro dosažení vysoké selektivity a citlivosti.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Vanquish Flex Duo ve konfiguraci pro přímou injekci
• Hybrydní kvadrupól-Orbitrapový hmotnostní spektrometr Thermo Q Exactive Plus s HESI-II ionizátorem
• Softwarové zpracování Thermo TraceFinder 5.1
• Kit ClinMass Complete Kit for Free Metanephrines in Plasma (RECIPE Chemicals + Instruments)

Použitá metodika

Pro přípravu vzorků bylo 500 µl plazmy smícháno s deuterovanými interními standardy a aplikováno na kondicionované SPE kazety. Po promytí byl analyt eluován močovinovým a organickým pufrem a eluát injikován přímo (50 µl) bez nutnosti odpařování.
Kapitální parametry chromatografie: analytická kolona RECIPE, teplota 25 °C, gradient od 5 % do 30 % organické fáze v průběhu 2 minut, celkový běh 4 minuty, průtok 0,6 ml/min.
Hmotnostní spektrometrie byla provozována v pozitivním iontovém módu v režimu Full Scan (rozlišení 35 000, m/z 80–200) s daty řízenou MS2 akvizicí (rozlišení 17 500) a selekcí dvou fragmentů pro každou látku.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu s vážením 1/x v celém kalibračním rozsahu a detekční limity (LLOQ) 13,5 ng/l pro 3-methoxytyramin, 5,6 ng/l pro metanefrin a 40,9 ng/l pro normetanefrin. Back-calculated bias nepřesáhl ±15 % (±20 % na nejnižší úrovni). Nepozoroval se carryover. Intra-assay přesnost (CV) byla < 8,7 % a inter-assay < 6,9 %. Trueness ověřených externích QC prokázala bias < 10 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a přesnost díky HRAM Orbitrap technologii
• Jednoduchá off-line SPE extrakce bez odpařování a rekonstituce
• Rychlý analytický běh (4 minuty) vhodný pro vysokoprůtoková měření
• Využití v klinickém výzkumu pro screening a monitorování metabolitů katecholaminů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a integrace on-line SPE pro další zvýšení průtokovosti
• Rozšíření panelu o další biogenní aminy pro komplexní metabolomická vyšetření
• Využití umělé inteligence pro rychlejší vyhodnocení dat a prediktivní analýzu
• Miniaturizace odběru a zpracování vzorků v bodě péče (point-of-care)

Závěr

Popisovaná metoda propojuje robustní off-line SPE s vysoce rozlišenou LC-HRAM MS analýzou a plní požadavky klinického výzkumu na citlivost, přesnost a rychlost. Výsledky potvrzují její vhodnost pro rutinní kvantifikaci volných metanefrinů v plazmě.

Reference