Quantification of 25-hydroxyvitamin D2 and D3 in human plasma by liquid chromatography coupled to high-resolution Orbitrap mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Vitamin D je klíčový pro regulaci vápníku a fosfátu v organismu a má zásadní roli v prevenci kostních onemocněnÍ, jako je osteomalacie nebo rachitis. Současně jeho nedostatek ovlivňuje riziko kardiovaskulárních a autoimunitních chorob. Spolehlivá a přesná kvantifikace 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě je proto nezbytná pro klinický výzkum, diagnostiku a sledování léčby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo představit validovaný analytický postup pro měření 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě za pomoci kapalinové chromatografie spojené s vysokorozlišovacím Orbitrap MS. Metoda využívá komerční přípravný kit ClinMass® a offline precipitaci proteinů s interním standardem d6-25-OH-Vitamin D3. Detekce analyzů byla prováděna v režimech FullMS a PRM na přístroji Q Exactive™ Plus.

Použitá instrumentace

• Vanquish™ Duo UHPLC systém s online SPE modulací
• Q Exactive™ Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap s APCI zdrojem
• Analytické a SPE kolony, reagentní kit ClinMass® od RECIPE Chemicals + Instruments

Použitá metodika

Vzorek 50 µL plazmy byl smísen se srážecím roztokem obsahujícím interní standard, poté rekonstituovaný supernatant injektován na online SPE-LC. Chromatografická separace probíhala prouděním vhodných mobilních fází s celkovým cyklem 3 minut. Detekce na Orbitrapu byla nastavena pro pozitivní ionizaci APCI, při níž se analyty měřily v režimech plného skenu a fragmentačním režimu PRM. Kvantifikace se opírala o kalibrační křivky s 1/x vážením a čtyřmi kalibrátory do rozsahu ~10–80 ng/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu v celém kalibračním rozsahu i pod LLOQ. LLOQ bylo stanoveno na 1,8–4,9 ng/mL, procentní bias zpětně dopočítaných koncentrací v rámci ±15 % (±20 % pro nejnižší bod) a maximální přenos pozůstatků činil 0,4 %. Intra- i inter-denní precizita (%CV) byla pod 11,3 % a interdenní variabilita nepřesáhla 9,3 %. Obě akviziční strategie poskytují srovnatelnou citlivost a přesnost, přičemž PRM nabízí vyšší selektivitu fragmentační kontroly.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje rychlé a robustní stanovení 25-OH-D2 a D3 v biologickém matriálu, vhodné pro klinický výzkum i preklinická hodnocení. Offline precipitace proteinů s interním standardem zjednodušuje přípravu vzorků a online SPE zkracuje dobu analýzy na 3 minuty. Vysoká reprodukovatelnost a nízké LLOQ umožňují spolehlivé sledování vitaminu D i při nízkých koncentracích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení vysokorozlišovací MS technik v klinické rutinní praxi pro detailní profiling vitamínů a jejich metabolitů. Kombinace FullMS a PRM režimů může být rozšířena o multidimenzionální separace a automatizaci přípravy vzorků. Další vývoj kitů pro různé biologické matricím a validace v rámci interlaboratorních studií posílí standardizaci metod.

Závěr

Byl vyvinut a validován rychlý, citlivý a reprodukovatelný LC-HRMS postup pro stanovení 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v plazmě. Metoda splňuje požadavky na linearitu, přesnost i precizitu pro klinické výzkumné aplikace.

Reference

• De Nardi C., Kern K., Peters S. Quantification of 25-hydroxyvitamin D2 and D3 in human plasma by liquid chromatography coupled to high-resolution Orbitrap mass spectrometry for clinical research. Technical Note No. 73234, Thermo Fisher Scientific, 2019.